UPLCMS/MS法同时测定不同动物源性食品中硝基呋喃代谢物残留

吕珍珍,程 泷,李昌松,张 娴,罗中魏,潘志明,*

(1.德阳市食品药品安全检验检测中心,四川德阳 618000;2.德阳市食品检验重点实验室,四川德阳 618000;3.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;4.四川华胜农业股份有限公司,四川德阳 618000)

硝基呋喃类药物是一种被广泛用于水产业和畜禽养殖业的抗菌药物,对一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫具有抑制和杀灭作用,通常用于预防和治疗禽类因感染沙门氏菌和大肠埃希菌而产生的疾病[1-3]。然而,硝基呋喃类药物具有潜在的致畸、致癌、致突变作用,其滥用造成动物体内兽药残留,最终危害食用人群的身体健康[4]。欧盟1995年EC/1442/95将呋喃唑酮列为不得检出药物[5-6];我国农业部在2002年发布1号、193号、235号公告明确禁止呋喃它酮、呋喃唑酮用于所有动物源性食品,规定其不得检出,在2005 年的560号公告中将呋喃西林、呋喃妥因列为禁用兽药[7-8]。

目前,硝基呋喃类药物的检测方法有高效液相色谱法[9](High performance liquid chromatography,HPLC)、高效液相色谱串联质谱法[10-12](Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)、酶联免疫法[13-14](Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、荧光免疫分析法[15](Fluoro immune assay,FIA)等。其中色谱串联质谱法仍然是主要的检验检测方法。LC-MS/MS具有较高的灵敏度,较好的选择性和特异性,可以提供待测物的结构信息[16-17]。然而,诸如LC-MS/MS等此类仪器分析方法通常前处理耗时长、成本高[18-19],并且现有研究方法多局限于某一种基质,因此,非常有必要建立一种准确快速的不同基质中硝基呋喃类药物残留的检测方法。

硝基呋喃类药物被摄入体内后极不稳定,其代谢产物包括氨基脲(SEM)、1-氨基乙内酰脲(AHD)、3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)[20-22]。本研究采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS),以猪肉、猪肝、螃蟹和虾4种不同的动物源性样品作为研究对象,优化前处理步骤,构建用于同时测定硝基呋喃类药物4种代谢产物的检测方法,以期为硝基呋喃类药物等兽药残留检测技术提供理论支撑和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜淡水虾5批、淡水蟹3批、海水虾4批、海水蟹4批、小龙虾2批、猪肉42批、猪肝20批 当地农贸市场;鸡肉中呋喃唑酮代谢物(AOZ,特性值7.60 μg/kg、量值范围3.84～11.35 μg/kg)、呋喃它酮代谢物(AMOZ,特性值7.75 μg/kg、量值范围2.94～12.56 μg/kg)定量分析质控样品 中国检验检疫科学研究院测试评价中心;3-氨基-2-恶唑酮(AOZ)、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)、氨基脲(SEM) 标准值100 mg/L,内标标准储备液:AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C15N2,标准值50 mg/L,农业部环境保护科研监测所;甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯 色谱纯,德国Merck公司;甲酸(含量85.0%) 韩国德山药品工业(株);2-硝基苯甲醛(纯度99%) 上海谱振生物科技有限公司;乙酸铵(纯度98.0%) 北京百灵威科技有限公司。

液相色谱-串联质谱仪、Agilent1290超高效液相色谱 美国安捷伦公司;Q-TRAP 4500三重四极杆/复合线性离子阱质谱,配有电喷雾离子源(ESI)、MultiQuantTM定量软件 美国AB SCIEX公司;UV-R超纯水机 法国Millipore公司;TGL-16A台式高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司;VG3 S025涡旋振荡器、T25高速组织匀浆机 德国IKA公司;MS205DU电子天平、S220pH测定仪 瑞士Mettler-Toledo公司;ZWYR-240恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;MTN-5800A氮吹浓缩装置 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;VP6122050抽滤装置 美国Cole-Parmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 硝基呋喃代谢物标准工作液:硝基呋喃代谢物标准储备液用甲醇稀释,配制成各组分浓度均为 0.1 μg/mL 的硝基呋喃代谢物标准工作液;硝基呋喃代谢物内标标准工作液:硝基呋喃代谢物内标标准储备液用甲醇稀释,配制成各组分浓度均为0.1 μg/mL的硝基呋喃代谢物内标标准工作液;衍生化试剂(0.1 mol/L):准确称取1.50 g 2-硝基苯甲醛,用甲醇溶解并定容至100 mL。

1.2.2 样品水解和衍生化 鸡肉中AOZ和AMOZ质控样品开启真空包装袋后称取0.50 g鸡肉冻干粉样品,加入总计1.50 g的蒸馏水搅拌15 min混匀,混匀后的样品为肉糜状,即为复原样品;称取0.50 g鸡肉冻干粉样品经过复原后等同于2.00 g鸡肉糜样品。猪肉、猪肝、螃蟹、虾样品去皮去骨去壳,取可食用部分用组织捣碎机充分打碎混匀,装入聚乙烯瓶中,于-18 ℃冷冻保存,测定前解冻、称样;称取约2.00 g(精确至0.01 g)的猪肉、猪肝、螃蟹和虾样品和复原后的鸡肉糜样品于50 mL的塑料离心管中,加入8 mL 0.2 mol/L的盐酸,涡旋震荡1 min 后,按照最终定容浓度10 ng/mL加入混合内标标准溶液,加入100 μL 2-硝基苯甲醛溶液,涡旋混合30 s,置37 ℃恒温培养振荡器震荡16 h。

1.2.3 提取和净化 取出样品,冷却至室温,加入1 mL 0.3 mol/L磷酸钾溶液,用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为7.5±0.5,加入8 mL乙酸乙酯,震荡提取5 min后,以10000 r/min离心5 min,收集乙酸乙酯层;残留物用8 mL乙酸乙酯再提取一次,合并乙酸乙酯层。收集液在40 ℃下氮气吹干,残渣用1 mL初始流动相充分溶解,再用1 mL乙腈饱和的正己烷液液萃取,弃去正己烷层去除脂肪,下层过0.2 μm滤膜待测。整个操作过程应避光进行。研究各因素最佳水平时,均吸取0.1 mL浓度为0.1 μg/mL混合外标标准溶液和混合内标标准溶液到猪肉样品中,作为加标。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱温:30 ℃;进样体积:10 μL;流动相:A为0.1%甲酸水溶液(含0.0005 mol/L乙酸铵),B为乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.5 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描,多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM),电喷雾电压(IS):5500.0 V,碰撞气(CAD):Medium,离子源温度(TEM):550 ℃。4种硝基呋喃类类代谢物及其同位素内标的多反应监测离子对见表2。

表2 4种硝基呋喃代谢物衍生物和相应内标物的质谱参数Table 2 MS parameters of four nitrofuran metabolites and corresponding internal standards

1.3 数据处理

采用Excel和Origin 8.5进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本试验首先对流动相和色谱柱进行了优化研究。以甲醇和乙腈作为流动相,分别考察在Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Agilent Eclipse SB C18RRHD(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)两种长度的C18色谱柱中硝基呋喃代谢物衍生物的分离效果和峰形。使用100 mm的C18色谱柱,以乙腈为流动相能获得更尖锐对称的色谱峰,且4种代谢物的分离效果更好。正离子模式下,在水溶液中添加一定浓度的甲酸能够有效地提高分析物的离子化效率,试验以0.1%的甲酸水溶液(添加0.0005 mol/L乙酸铵)和乙腈对4 种硝基呋喃类代谢物衍生物梯度洗脱,乙腈的初始比例为10%,然后在6 min内线性增加至75%,使各化合物在C18柱中保留增强,分离度和峰形良好,灵敏度高,4种硝基呋喃类代谢物衍生物的总离子流图见图1;由于动物源性样品基质复杂,在6.5～9.5 min将乙腈比例增加至95%,防止未知物在色谱柱中蓄积,有利于洗脱出更多杂质;9.5～13.0 min时间内,将乙腈的比例从95%降低为初始比例10%,充分平衡色谱柱,为下一针进样做准备。优化后的方法单个样品进样时间为13.0 min,相比于GB/T 21311-2007、GB/T 20752-2006和农业部781号公告-4-2006三种方法,更加节约时间,且有效的保护了色谱柱,为大批量进样提供保障。

图1 猪肉样品中4种硝基呋喃代谢物衍生物总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of the 4 kinds ofnitrofuran metabolites in porcine muscle

2.2 质谱条件的优化

在空白猪肉基质中添加混合内标、外标标准溶液,按照试验方法进行前处理后上机。选择ESI+的电离模式,对4种硝基呋喃代谢物及内标进行一级质谱扫描,获得较高响应母离子[M+H]+。对去簇电压和碰撞能量分别进行优化,使选定的特征碎片离子强度达到最大。选取2个丰度强且稳定的碎片离子作为定性与定量离子,以满足欧盟657/2002/EC号指令对于禁用药物液相色谱质谱方法定性监测的规定,满足1个母离子、至少2个子离子共4个识别点数的要求(见表2)。样品基质中,AHD的m/z为 133.9和103.9两个碎片离子的响应信号较强,很多研究以这两个碎片离子和准分子离子峰构成监测离子对;但是在提取碎片离子色谱图时发现猪肉基质AHD出峰位置的保留时间±0.3 min内左右各有一个小色谱峰。为了进一步研究这个现象,分别使用猪肝、虾、蟹三种基质做添加,以及不加样品基质直接水解衍生进行上机测试。试验发现,不加样品基质、虾、蟹提取AHD的133.9和103.9两个碎片离子只提取出一个色谱峰,猪肝样品基质中提取AHD的133.9和103.9两个碎片离子仍然有三个色谱峰,和猪肉样品一样,对丰度强且稳定的碎片离子再次进行提取,发现m/z为178.0的碎片离子只提取出一个AHD色谱峰,因此,以m/z为133.9、103.9和178.0这三个碎片离子和准分子离子249.0构成监测离子对,确保得到准确的定性定量结果。

2.3 样品洗涤液的选择

GB/T 21311-2007、GB/T 20752-2006和农业部781号公告-4-2006三种方法中都采用甲醇水对样品进行洗涤,以除去部分蛋白质、脂肪等杂质,在相关文献中尚未发现对该部分的研究。本试验加标后依据样品处理过程进行试验。比较了不使用洗涤液和不同比例的水与甲醇洗涤液对回收率的影响。水与甲醇的比例分别设置为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8和1∶10,结果如表3所示,不同比例的水与甲醇洗涤液和不使用洗涤液,加标回收均在89.5%～95.8%之间,且差别不明显。因此,试验最终选择不使用洗涤液,能够有效的节约时间和成本。

表3 不同比例的水和甲醇洗涤液对回收率的影响(n=6)Table 3 Effects of different proportions ofwater and methanol on the recovery(n=6)

2.4 水解衍生化后pH的调节

内源性硝基呋喃代谢物以蛋白结合物的形态存在于样品中,经盐酸水解,释放出硝基呋喃代谢物,同时加入2-硝基苯甲醛衍生16 h。在酸性条件下,硝基呋喃代谢物的含氮亲核基团胺基(-NH2)与衍生剂的酮醛基团(-CHO)基团发生醛胺亲和加成反应[23]。衍生化后,4种代谢物衍生物的分子离子质荷比增大至m/z 200以上,适合质谱检测。在水解衍生化后进行萃取操作时,溶液的pH对回收率影响很大。本研究设计了pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的8个梯度进行试验,其余试验操作同1.2。结果如图2,pH在7～8的范围内回收率最高,pH偏低或过高均会影响回收率。pH偏低产生的影响更大,这可能是由于pH过低,在酸性条件下衍生物含-N、-NH2形成盐酸盐,无法萃取出来。因此,在水解衍生化后pH应调节在7.5±0.5的范围内,最有利于得到更好的回收。

图2 水解衍生后不同pH得到的4种硝基呋喃代谢物回收率Fig.2 Recoveries of 4 kinds of nitrofuranmetabolites at different pH values

直接用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5±0.5较花费时间,先加入1 mL(0.3 mol/L)磷酸钾形成缓冲体系,再用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH更加容易。在调节pH时,一定要充分涡旋水解衍生化后的混合溶液,并且要用玻璃棒挤压样品基质,使其中的酸被充分释放出来。通过上述过程对溶液pH进行调节,能够保证获得更好的基质标线和更高的回收率。

2.5 提取次数对硝基呋喃类代谢物回收率的影响

采用更少提取次数得到更高的回收率能够有效的节约试剂和时间。本研究加标后依据样品处理过程进行试验。比较了分别用8 mL乙酸乙酯进行1次、2次、3次提取(n=6),发现用8 mL乙酸乙酯进行1次、2次、3次提取得到的平均回收率分别为85.1%、96.1%和96.5%,精密度分别为6.5%、5.8%和4.9%。其中乙酸乙酯提取2次得到的平均回收率最高,这可能是由于1次提取并没有将所有的硝基呋喃类代谢物衍生物提取出来;3次提取与2次提取回收率差别并不大,因此,试验最终选择用8 mL乙酸乙酯进行2次提取即可得到最佳的回收率。

2.6 定容溶液对检测的影响

定容溶液可能产生溶剂化作用,影响某些化合物在色谱柱中的保留效果、离子化效率等,进而影响峰形和灵敏度。试验比较了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液(含0.0005 mol/L乙酸铵)和梯度洗脱表中初始比例的流动相3种溶液定容。发现0.1%甲酸水溶液作为定溶液时,SEM的响应低;AHD峰分叉,与左右两个小峰无法分开。0.1%甲酸水溶液(含0.0005 mol/L乙酸铵)作为定溶液时,SEM的响应较甲酸水溶液作为定溶液时略有提高,但AHD峰情况相同。采用梯度洗脱表中初始比例的流动相定容,SEM的响应最高,且AHD峰峰形较好,能够与其它杂峰有效分离,结果见图1。这与赵东豪等[24]研究结果一致。

2.7 标准工作曲线、检出限和定量限

本试验分别采用4种硝基呋喃代谢物的同位素标记物作为内标物,能够有效减少各操作步骤对回收率的影响,并且采用试验验证为未检出的阴性样品基质配制标准曲线,使定量更加准确。称取5份约2.00 g(精确至0.01 g)的阴性样品于50 mL的塑料离心管中,加入8 mL 0.2 mol/L的盐酸,涡旋震荡1 min后,按照最终定容浓度1、5、10、50、100 ng/mL加入混合标准工作液,按照最终定容浓度10 ng/mL加入混合内标标准工作液,余下操作同1.2实验方法。以各定量离子离子质量色谱峰面积与相应内标物的峰面积比为纵坐标,对照溶液的浓度为横坐标制作标准曲线,各回归方程和相关系数如表4所示。回归方程及相关系数表明,采用本方法对4种不同的样品基质中硝基呋喃代谢物进行检测,在 1～100 ng/mL范围内线性关系良好。以3倍信噪比(S/N)计算得到检出限(LOD),10倍信噪比(S/N)计算定量限(LOQ)得到在各种样品基质中,AOZ的检出限为0.1 μg/kg、定量限为0.4 μg/kg,SEM和AMOZ的检出限为0.2 μg/kg、定量限为0.5 μg/kg,AHD的检出限均为0.5 μg/kg、定量限为1.0 μg/kg。

表4 4种样品基质中4种硝基呋喃代谢物的回归方程Table 4 Regression equations of four nitrofuran metabolites in four samples

2.8 方法回收率和精密度

在4种阴性样品基质中分别加入硝基呋喃代谢物混合标准溶液,使样品中终含量为1、2和5 μg/kg,按照最终定容浓度10 ng/mL加入混合内标标准溶液。参照样品处理过程进行标回收率试验,每个添加水平做6次平行样品处理及上机测定,回收率结果和相对标准偏差RSD结果见表5。由表5可以看出,4种代谢物的平均回收率在84.6%～118.1%之间;相对标准偏差RSD在2.9%～8.1%之间。根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中回收率的相关规定,被测组分含量小于0.1 mg/kg时,回收率范围在60%～120%内实验结果可信。

表5 4种样品基质中4种硝基呋喃代谢物的回收率和精密度Table 5 Recoveries and RSDs of four nitrofuran metabolites spiked in four blank samples

2.9 实际样品的检测

为了进一步验证方法的可靠性,采用本方法和国家标准方法GB/T 20752-2006分别对市场上随机购买的80份动物源性样品和鸡肉中硝基呋喃代谢物质控样进行检测。样品分布包括淡水虾5批、淡水蟹3批、海水虾4批、海水蟹4批、小龙虾2批、猪肉42批、猪肝20批,检测结果如表6所示。除表6所列4个样品检出阳性,其余样品均为未检出,检出率达到5%。可以看出,硝基呋喃代谢物检出的项目主要为AOZ和SEM,且主要集中在淡水虾、淡水蟹两个品种。通过国家食品药品监督管理总局网站查询发现硝基呋喃类不合格的农产品中主要也是AOZ和SEM,集中于水产品。这可能是由于AOZ可用于罗氏沼虾、鳗鲡、对虾和河蟹等水生动物养殖环境的消毒药物,还可用于防治畜禽肠道感染;SEM一般用作外用消毒药物,也有拌饵投喂防治水生动物疾病的作用[25]。考虑到硝基呋喃代谢物对人体的影响,对硝基呋喃代谢物进行快速准确的检测具有非常重要的意义。使用本方法与国标方法GB/T 20752-2006测定结果相近,质控样的检测结果都在量值范围内,表明本方法能够满足硝基呋喃代谢物的定性定量筛查,且本方法不需要使用国家标准中的Oasis HLB固相萃取柱,能够有效的节约成本和时间。

表6 阳性样品检测结果(n=2,μg/kg)Table 6 Detection results of positive samples(n=2,μg/kg)

3 结论

现有硝基呋喃代谢物检测的研究主要针对单一动物源性样品,本研究探索了不同动物源性样品基质中硝基呋喃代谢物的检测。结果表明本方法在1～100 ng/mL代谢物浓度范围内线性关系良好,回收率、精密度、检出限和定量限均满足国家标准要求,可用于肉、猪肝、螃蟹和虾4种动物源性样品基质中硝基呋喃代谢物的检测。相比于国标方法,本方法优化了样品前处理的条件以及UPLC-MS/MS仪器条件,更加节约时间和成本,适用于大批量检测不同品种的动物源性样品。本方法还可进一步探究其在其他动物源性样品基质中硝基呋喃代谢物检测的可行性。