反相高效液相色谱法测定滋肾育胎丸中金丝桃苷、毛蕊花糖苷和二苯乙烯苷含量

2020-06-17杨丽娟张君娜苗晓红

中国药业 2020年11期

杨丽娟，张君娜，苗晓红，辛娜

（1.河北省石家庄市妇幼保健院产科，河北石家庄 050000； 2.河北省石家庄市第四医院药剂科，河北石家庄 050000； 3.河北省唐山市妇幼保健院产科，河北唐山 063000）

滋肾育胎丸是由菟丝子、砂仁、熟地黄、杜仲、人参、桑寄生、阿胶（炒）、首乌、艾叶、巴戟天、白术、党参、鹿角霜、枸杞子、续断等15味药材组方的中药成方制剂，临床用于治疗脾肾两虚、冲任不固所致滑胎，防治习惯性流产和先兆性流产[1-3]。方中菟丝子具有补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等功效[4-6]，熟地黄具有补血滋阴、益精填髓等功效[7-9]，杜仲具有补肝肾、强筋骨、安胎等功效[10-12]。其质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第16册)》（WS3-B-3113-98），但仅对性状、鉴别和检查项作出规定，无含量测定项，无法更全面地控制滋肾育胎丸质量。方中菟丝子为君药，杜仲为臣药，熟地黄为佐药，且3种药材活性成分毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷均在紫外光区有较强吸收。本研究中采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法检测中成药滋肾育胎丸中金丝桃苷、毛蕊花糖苷和 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯 -2-O-β -D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）3种活性成分的含量[13-17]，旨在为药品标准的完善提供技术参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-1260 INFINITY型高效液相色谱仪（包括在线脱气机、G1313A自动进样器、G1316C自动柱温箱和G1315C二极管阵列检测器，美国安捷伦公司）；BSA 124S-CW型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；Multiskan Sky型紫外可见分光光度计（美国热电公司）；Milli-Q Advantage A10型纯水仪（美国密理博公司）；KQ-300TDE型高频超声波清洗仪（昆山舒美仪器公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

图1 高效液相色谱图

1.2 试药

金丝桃苷对照品（批号为111521-201809，含量以94.9%计），毛蕊花糖苷对照品（批号为 111530-201713，含量以 92.5% 计），2，3，5，4′- 四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号为110844-201814，含量以91.0%计），均购自中国食品药品检定研究院；滋肾育胎丸（广州白云山中一药业有限公司，规格为每瓶 60 g，批号分别为 S00015，ER00012，W00103）；磷酸、冰醋酸（优级纯，国药集团）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Spherisorb ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）；检测波长：346 nm；柱温：27 ℃ ；流速：1.0 mL ／min；进样量：15 μL；流动相：乙腈（A） -0.2%磷酸溶液（B，移取 2.0 mL磷酸至 1 000 mL容量瓶中，超声5 min，放冷），梯度洗脱(0～6 min时12%A，6～22 min时12%A～48%A，22～30 min时48%A～80%A，30～31 min时 80%A～12%A，32～36 min时12%A)。

2.2 溶液制备

取金丝桃苷 26.34 mg、毛蕊花糖苷 27.03 mg、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯 -2-O-β-D-葡萄糖苷27.47 mg，精密称定，置 25 mL容量瓶中，加 95%甲醇20 mL，超声溶解，取出放冷，定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液。精密移取对照品贮备溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取样品适量，研钵研成细粉，过80目筛网，取细粉1.0 g，精密称定，置20 mL容量瓶中，加 95%甲醇 15 mL，超声处理（功率 200 W，频率 60 kHz）20 min，取出放冷，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。按处方制备方法和药材配比比例，制备缺紫苏子、熟地黄和杜仲药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液，按拟订色谱条件分别进样，记录色谱图。结果毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷峰分离良好，分离度均不低于1.5，理论板数和拖尾因子等均符合《中国药典》要求，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：取2.2项下对照品贮备溶液适量，加入 95% 甲醇，得质量浓度分别为 0.04，0.10，4.00，8.00，16.00，32.00 μg ／mL 的系列标准溶液，按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图。以3种活性成分的质量浓度（X）为横坐标、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。可见，毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷质量浓度在 0.04 ～32.0 μg／mL 范围内与其峰面积线性关系良好。

表1 3种活性成分线性回归方程、线性范围及相关系数(n＝6)

稳定性试验：取样品（批号为S00015），依法制备供试品溶液，于室温下放置 0，3，6，9，12，24 h 时，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，并根据色谱图中3种活性成分峰面积计算 RSD。结果毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷峰面积的 RSD分别为2.13%，1.02%，1.91%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为S00015）6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样分析，记录色谱图，并计算 RSD。结果毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷含量的 RSD 分别为 3.09% ，2.31% ，3.38%（n＝6），表明方法重复性良好。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，记录色谱图；按3种活性成分峰面积计算 RSD。结果毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷峰面积的 RSD 分别为 1.64%，0.93%，1.37% （n＝6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为S00015），研钵研成细粉，过 80 目筛网；取细粉 1.0 g，精密称定，置20 mL容量瓶中，称取6份，依照供试品溶液制备方法进行处理，得6份样品加样溶液；按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图，计算3种活性成分加样回收率。结果见表2。

表2 3种活性成分加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件分别进样分析，采集色谱图，根据峰面积计算含量。结果见表3。

表3 各批样品中3种活性成分含量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 检测波长优化

分别配制含毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷质量浓度为8 μg／mL的标准溶液，加95%甲醇溶解并定容，取上述标准溶液分别在190～400 nm波长范围内扫描。结果毛蕊花糖苷、金丝桃苷和二苯乙烯苷分别在335，359，321 nm波长处有最大吸收；取对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录190～400 nm全波段谱图，结果于346 nm波长处3种活性成分响应最佳，故选择346 nm作为检测波长。

3.2 流动相优化

曾选择乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液和乙腈-0.4%磷酸溶液作为流动相体系，考察不同体系对3种活性成分分离和峰形的影响。按拟订色谱条件分别选择上述4种流动相体系，分别进样对照品溶液、阴性对照品溶液和供试品溶液，采集色谱图。结果选择乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相体系时，3种活性成分完全分离，且各色谱峰峰形较好。故选择其作为流动相体系。

3.3 色谱柱优化

曾选择色谱柱 Waters sunfire C18，Agilent Zorbax XDB C18，Waters Spherisorb ODS C18和 Kromasil C18作为分离柱，考察不同色谱柱对3种活性成分分离情况的影响。结果以色谱柱Waters Spherisorb ODS C18作为分离柱时，3种活性成分完全分离，故选择其作为分析柱。

3.4 提取条件优化

滋肾育胎丸由15味药材加工而成，基质较复杂，选择最佳的提取条件对消除基质干扰有重要作用。分别选择甲醇和95%，90%，85%甲醇溶液时，考察对滋肾育胎丸中3种活性成分的提取效果，结果选择95%甲醇溶液时提取效果最佳。确定提取溶剂后，分别考察超声时间（10，15，20，25，30 min）和超声功率（150，180，200，220，250 W）的影响，最终确定95%甲醇溶液作为提取溶剂，功率为200 W、时间为20 min为最佳提取条件。