叶酸代谢相关基因多态性与男性精子异常的相关性研究

王志强，陕文生△，田昕，刘春辉，孙庆梅，俞国强，刘霄雯

据世界卫生组织（WHO）统计，全世界约有15%的育龄夫妇遭受不育的困扰，其中男方因素约占50%［1］。男性不育中高达60%～75%为特发性男性不育，表现为原因不明的少精、弱精和（或）畸形精子症等精子质量异常［2］。随着基因检测技术的发展，从遗传角度探索特发性男性不育的原因成为目前的研究热点，其中叶酸代谢相关基因多态性与男性不育的关联性越来越受到关注。叶酸代谢关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因多态性可改变酶活性，一方面影响DNA 甲基化过程［3］，另一方面可导致高同型半胱氨酸（HCY）血症［4］，两者均可影响正常精子发生的过程以及精子活力，最终降低男性生育能力。但目前研究对叶酸代谢基因多态性与男性不育的相关性尚存争议。研究多针对MTHFR C677T位点，而有关MTHFR A1298C和MTRR A66G位点的研究尚少见，而后两个位点多态性也是影响叶酸代谢及高HCY血症的重要因素。本研究针对有精子质量异常的特发性男性不育患者及有不良孕产史的男性患者进行MTHFR 和MTRR 基因多态性的检测，探讨MTHFR C677T、MTHFR A1298C 和MTRR A66G 位点基因多态性与男性不育的关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月—12月在甘肃省妇幼保健院男科就诊的汉族男性929 例，年龄19～45 岁，平均（30.56±4.98）岁。其中患有精子异常症者（精子异常组）290例，平均年龄（29.85±4.85）岁；妻子有不明原因不良生育史者（不良孕产组）198例，平均年龄（31.41±5.60）岁；妻子有自然生育史的健康者（对照组）441 例，平均年龄（30.64±4.70）岁，3 组间年龄差异无统计学意义（F=0.423，P＞0.05）。纳入及排除标准：（1）在男科就诊并进行叶酸代谢能力遗传检测的患者。（2）精子异常组接受精液常规分析被确定为弱精/少精/精子畸形症（《WHO 人类精液处理检查与实验室手册》第5 版）。（3）排除患有泌尿系统疾病、性传播疾病、染色体异常、免疫异常等疾病患者以及患精神疾病、恶性肿瘤等不能配合研究者。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器及试剂 Buffer A、Buffer B、饱和酚、氯化钠及异丙醇等试剂以及低温离心机（Beckman J-6BABI）、7900 型荧光定量PCR 仪等仪器均购自美国Applied Biosystems（ABI）公司。

1.3 基因多态性分析方法 采集口腔黏膜上皮细胞，采用硅胶吸附法提取基因组DNA。采用荧光定量PCR 技术检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点单核苷酸多态性（SNP）。PCR 反应体系为10 μL，包含1 μL 基因组DNA（20 mg/L），5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB 探针（序列见表1），3.5 μL 去离子水。反应条件：95 ℃预变性10 min；92 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，20个循环；89 ℃变性15 s，60 ℃延伸90 s，30 个循环。反应完成后，在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，3 组间比较采用单因素方差分析，多重比较行LSD-t检验；各基因型分布、等位基因频率比较采用χ2检验。采用Hardy-Weinberg平衡定律检验各组样本代表性。采用Logistic 回归分析不良妊娠的影响因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Location of Taqman-MGB probe表1 Taqman-MGB探针所在位置

2 结果

2.1 各基因位点基因型的Hardy-Weinberg 平衡分析 精子异常组、不良孕产组和对照组男性MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 位点基因型符合Hardy-Weinberg 平衡定律（精子异常组χ2分别为0.409、0.010、3.464，不良孕产组χ2分别为0.909、2.514、0.040，对照组χ2分别为3.588、0.851、0.873，均P＞0.05），3组样本均具有群体代表性。

2.2 MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 基因型及等位基因分析 精子异常组和不良孕产组的MTHFR C677T 位点TT 基因型频率均高于对照组（P＜0.05），等位基因分布与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。精子异常组的MTHFR A1298C位点基因型和等位基因分布与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。不良孕产组的MTHFR A1298C位点CC 基因型频率高于对照组（P＜0.05），等位基因分布与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。精子异常组和不良孕产组的MTRR A66G 位点AG、GG 基因型频率高于对照组（P＜0.05），等位基因分布与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、3。

2.3 精子异常及不良孕产发生的多因素Logistic 回归分析 分别以精子异常（对照组=0，精子异常=1）、不良孕产（对照组=0，不良孕产=1）为因变量，以MTHFR C677T（CC=0，CT=1，TT=2）、MTHFR A1298C（AA=0，AC=1，CC=2）和MTRR A66G（AA=0，AG=1，GG=2）为自变量，进行多因素Logistic 回归分析。结果显示，MTHFR C677T 位点的TT 基因型和MTRR A66G的AG、GG基因型是精子异常发生的独立危险因素（P＜0.05）；MTHFR C677T 位点的TT 基因型、MTHFR A1298C 位点的CC 基因型和MTRR A66G的AG、GG基因型是不良孕产发生的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

Tab.2 Comparison of genotype frequency distribution between MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G groups表2 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 3组基因型频率分布比较［例（%）］

Tab.3 Comparison of allele frequency distribution between MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G groups表3 3组MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G等位基因频率分布比较［例（%）］

Tab.4 Multi-Logistic regression results of risk factors for sperm abnormality and adverse pregnancy表4 精子异常、不良孕产的多因素分析

3 讨论

MTHFR 是叶酸代谢的关键酶，其将5，10-亚甲基四氢叶酸（5，10-methylenetetrahydrofolate，5，10-MTHF）转化为5- 甲基四氢叶酸（5-methyl tetrahydrofolate，5-MTHF），5-MTHF 为体内DNA、RNA 及蛋白质等物质的合成提供甲基，保证精子的顺利生成［5］。同时，5-MTHF 为高HCY 向甲硫氨酸（Methionine，Met）转化提供甲基，维持机体HCY 正常水平。MTHFR基因突变可引起酶活性降低，影响DNA 甲基化，导致染色体分离异常，影响精子的产生及功能［6］。基础研究方面，有研究表明敲除雄性小鼠的MTHFR 基因后，小鼠精子发育异常，最终导致不育［7］。Oakes 等［8］研究显示，给予小鼠甲基转移酶抑制剂可抑制其DNA甲基化反应，小鼠的精子活力低下。另一方面MTHFR 基因多态性可使体内HCY 水平升高，造成高HCY 血症，从而产生过量氧化应激反应，损伤精子DNA，引起精子功能异常［9］。而临床研究的结果却不一致，邹宇洁等［10］研究结果表明，MTHFR C677T基因多态性与男性不育人群的精子质量相关，其机制可能与精液活性氧水平有关；而胡丽丽等［11］对济宁地区的汉族男性进行研究，结果未发现MTHFR C677T 基因多态性与特发性男性不育症存在相关性。Gava 等［12］研究发现MTHFR C677T 多态性与巴西男性不育有密切关联；针对约旦人群的研究结果显示，MTHFR C677T多态性与男性不育有关，但与不育组的精液参数无相关性［6］；另有研究显示，西班牙人群中MTHFR C677T多态性在不育组与对照组的分布差异无统计学意义［13］。这些差异可能与不同种族或不同地区的人群差异有关，也可能与样本量差异有关。本研究结果显示，精子异常组与对照组在MTHFR C677T 位点基因型分布上有显著差异，TT 基因型频率显著高于对照组，而CT基因型频率却低于对照组，该位点等位基因频率分布上无显著差异。提示该位点TT 基因型可能是导致精子异常的因素，而CT基因型与精子异常的发生无关联性。Logistic 回归分析结果显示，MTHFR C677T 位点的TT 基因型是精子异常发生的独立危险因素，此纯合突变基因型发生精子异常的风险是CC野生型的1.65倍，与基因型分布规律一致。

MTRR 在HCY 的复甲基代谢途径中起重要作用，其协同辅酶维生素B12维持甲硫氨酸合成酶（Methionine synthase，MTR）的活性，使MTR 以5-MTHF为底物，催化HCY合成Met。MTRR基因突变会降低MTRR 活性，从而无法维持MTR 活性，阻碍HCY向Met转化，可能造成高HCY血症［14］。高HCY血症能使大量氧自由基在细胞内聚集，可能导致精子线粒体和核DNA 损伤，影响精子正常功能，降低生育能力［9］。本课题组前期研究结果表明，随着HCY 水平的增高，精子DNA 碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）水平也呈增高趋势。高HCY 血症还会损伤血管内皮，可能引起睾丸中血管发生动脉硬化，影响睾丸血流，导致生精功能障碍［15-16］。MTRR A66G 位点与男性不育的关联性在国内的研究相对较少，国内外的临床研究成果争议也较大。Lee 等［17］研究表明，MTRR A66G 多态性是男性不育的独立影响因素。而对巴西、约旦人群的研究结果显示，MTRR A66G多态性与男性不育无相关性［6，12］。但因目前发表的研究成果均为小样本研究，其结果说服力不足，还需扩大样本量进一步研究验证。本研究结果显示，精子异常组与对照组在MTRR A66G 位点基因型和等位基因分布上均有显著差异，精子异常组AG、GG基因型频率均高于对照组，提示该位点基因多态性分布与精子异常的发生有相关性。Logistic回归分析结果显示，MTRR A66G的AG、GG基因型是精子异常发生的独立危险因素，发病风险分别是野生型AA的4.199和5.849倍。

本研究还对妻子发生过不良孕产的男性叶酸代谢基因多态性进行了分析，其MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点的基因型分布与对照组存在显著差异。Logistic 回归分析结果显示，MTHFR C677T 位点TT 基因型、MTHFR A1298C 位点CC 基因型和MTRR A66G 的AG、GG 基因型是不良孕产发生的独立危险因素，不良孕产组以上4 个基因型频率显著高于对照组，这4 个基因型发生不良孕产的风险分别是各自的野生型MTHFR 677 CC、1298 AA 和MTRR 66 AA 的2.037、4.630、1.849、2.785倍。推测原因可能是MTHFR和MTRR基因突变影响机体DNA、RNA 及蛋白质等物质的甲基化，并引发高HCY血症，导致精子发生结构或功能上的改变，造成不良孕产的发生。但因本研究样本数量有限，仍需进一步研究验证。

综上所述，叶酸代谢相关基因MTHFR和MTRR的多态性与男性精子异常的发生具有相关性，且可能是不良孕产发生的危险因素。在不孕不育及孕前检查中，女性的叶酸代谢遗传基因现已受到临床的重视，而男性的叶酸代谢相关基因多态性也应同样得到关注。