应用于天然产物抗炎活性研究的主要细胞模型

刘燕芳，刘 丹，刘 兰，张 敉

昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500

炎症是人体为了抵御有害刺激并修复受损组织而产生的一种防御反应。据流行病学和临床资料显示，过度的炎症反应会反噬机体，造成二次病理损伤。研究表明：炎症不仅参与多种疾病的发生发展，包括我们熟知的类风湿性关节炎、动脉粥样硬化[1]、神经炎、哮喘[2]、炎性肠疾病和肾小球肾炎等疾病[3]，还可引发自身免疫疾病及癌症，并加速这类疾病的发展[4]。因此，研究和开发具有抗炎作用的药物具有重大意义。

先导化合物的发现是药物研究的重要阶段之一。这一阶段离不开灵敏、快速、经济、高效的药理模型来进行潜在的先导化合物的活性筛选。最早的筛选模型主要以动物为基础，可以得到大量的体内实验数据，但考虑到在利用动物模型进行筛选时，劳动密集耗费时间、经济成本高且不利于大规模筛选等因素，同时，动物模型筛选所需样品量较大，而实际工作中大部分先导化合物的前体往往来源于天然产物，它们相较于合成产物而言可谓是极微量的，所以，随着现代药理学的发展，先导化合物的高通量筛选已经更多转向了细胞水平。细胞模型兼具灵敏、快速、经济、高效的特点，重要的是其所需样品量小，更适合于天然产物的活性筛选。

本文综述了目前广泛用于筛选具有抗炎活性天然产物的细胞模型，以期为该类天然先导化合物的研究与开发提供一定参考。

1 单核/巨噬细胞模型

巨噬细胞是从血液中的单核细胞分化而来，可以发挥多种功能，包括呈现抗原、清除微生物和肿瘤细胞以及组织重塑。巨噬细胞具有广泛的病原体识别受体，通过吞噬和识别病原体相关分子模式参与先天和适应性免疫应答[5]；作为分泌细胞，可以通过激活机体的免疫系统，释放细胞因子，如一氧化氮(NO)、TNF-α、白细胞介素(IL-1、IL-6)等[6]；通过识别表面的特异性抗原，参与T辅助细胞(Th)的激活和炎症细胞因子和趋化因子的产生[7]。巨噬细胞还分泌粘附分子，这些分子促使淋巴细胞浸润到炎症病变部位，参与炎症过程。以下将介绍几种常见的单核/巨噬细胞炎症模型。

1.1 小鼠巨噬细胞RAW264.7模型

RAW264.7是由Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株(ATCC Number：TIB-71)。RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。对空间很敏感，喜聚集，成片生长，易吞噬抗原、易老化、易发生形态的变异，等长到更多更密时连成大片，并且会叠加成层。该细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，在炎症反应、免疫反应和吞噬反应中发挥着关键的作用，是微生物学、免疫学研究中的常用细胞株[8，9]。免疫学研究中常采用脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激RAW264.7细胞构建炎症反应模型，该细胞模型稳定，模型组和空白组的对比明显，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的分泌变化显著。例如细胞上清中IL-4、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2(PGE2)等炎症因子含量明显上升。因此，可利用该模型进行炎症活性筛选和机制的研究。

目前，天然产物的抗炎活性，以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞作为筛选模型应用非常广泛。通过评价药物对NO释放的影响、以及通过ELISA和Western blotting分析相关炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2等)和蛋白(诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX-2)等) 表达水平，是判断天然产物是否具有潜在的抗炎活性的有效手段。目前，利用该模型，已从很多天然药物中发现一系列活性先导化合物。例如，从荔枝草[10]中分离得到的倍半萜，在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中通过抑制NF-κB和细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2)信号通路表现出抗炎效果[11]。Shin 等[12]通过该模型研究发现，大蓟中的蓟黄素可抑制IL-6、TNF-α和NO产生，以及LPS诱导的转录因子如c-fos和信号转导以及转录激活因子3(STAT3)的活化，表现出显著的抗炎活性。从茵陈蒿中提取的精油能显著抑制LPS刺激RAW264.7细胞中NO的产生，研究表明该精油是通过阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的途径并抑制NF-κB的活化来抑制炎症介质的表达和产生[13]。中药连翘[14]中的连翘脂素可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6，并呈浓度依赖性下调COX-2和iNOS的蛋白表达[15]。从大叶山楝的根皮中提取的二萜二聚体对LPS诱导RAW264.7细胞产生的NO表现出显著的抑制作用[16]。初步统计，利用该模型筛选过的天然产物已超过5万。

1.2 小鼠巨噬细胞BMDM模型

骨髓来源巨噬细胞BMDM(bone marrow derived macrophage)通常是将C57BL/6小鼠的骨髓分离后收集，利用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导分化得到的[17-19]。呈不规则形或梭形，相比其他原代细胞，BMDM是均质的，具有增殖能力，可转染，并且寿命超过一周。目前，BMDM作为原代巨噬细胞，直接来源于机体组织，当生物性状尚未发生较大变化时，在一定程度上能反映体内状态，因此成为活性筛选和机制研究的良好模型。BMDM还可以用作原代细胞培养系统研究体外基因功能(例如消除转基因小鼠中的基因表达)，分析扩散改变、功能和基因表达[20]。另外，巨噬细胞是免疫系统中的特化细胞，执行许多任务如吞噬、抗原呈递、细胞因子产生和迁移等，这也是大多数免疫学研究选择BMDM作为炎症模型的主要原因[21]。

LPS诱导的基因表达在BMDM中具有高度选择性，研究表明多个转录因子家族可能都参与了BMDM的调控[22]。Ji等[23]利用LPS刺激BMMD细胞建立的体外炎症模型，研究了桃金娘科植物蓝桉总提物的活性，结果显示，该提取物可通过减弱IL-1β来抑制单钠尿酸盐 (MSU)诱导的腹膜炎，为其传统应用提供了科学支持。Lee等[24]利用偶发分枝杆菌感染BMDM细胞引起炎症反应的细胞模型研究发现，Toll样受体2(TLR2)-髓样分化初级应答基因88的信号传导可触发BMDM中TNF-α和IL-6的表达，并快速诱导炎症因子A20 (TNFAIP3)的表达。另有研究发现，中药黄芪[25]可抑制LPS刺激BMDM促炎因子TNF-α、IL-6的产生[26]，桦木科的昌化鹅耳枥叶的甲醇提取物对R848(Toll-like receptor7/8激动剂)刺激的BMDM细胞产生的促炎细胞因子IL-12 p40、IL-6和TNF-α具有剂量依赖性抑制作用[27]。

1.3 J774A.1细胞模型

小鼠单核巨噬细胞J774A.1来源于BABL/cN小鼠，属于贴壁细胞，呈圆形或椭圆形，有抗体依赖的吞噬作用，硫酸葡聚糖、PPD和LPS可抑制其生长，并产生IL-1β和大量的溶菌酶。J774A.1细胞是免疫系统中功能多样的效应细胞，在炎症反应的不同阶段发挥着不同甚至相反的功能[28]。

1.4 NR8383细胞模型

NR8383细胞来源于正常大鼠肺灌洗时的肺泡巨噬细胞[35]，属半悬浮细胞，呈圆形或椭圆形。NR8383细胞作为高响应肺泡巨噬细胞的均一来源，可以用于巨噬细胞相关活性的体外研究，尤其是肺部炎症[36,37]。NR8383细胞在博莱霉素刺激下，会分泌TNF-β前体，且TNF-βmRNA表达也会上升；NR8383细胞对内毒素也很敏感，10 ng/mL的LPS对该细胞的增生抑制率可达50%。

黄芩具有多种生物活性[38]，利用NR8383细胞炎症模型，发现其中的汉黄芩素能够抑制TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的转录和表达，降低PGE2、磷脂酶A2(PLA2)、白三烯B4(LTB4)、丙二醛(MDA)的浓度以及NO的产生和iNOS的活性，并通过抑制Toll样受体(TLR7)介导的髓样分化因子(MyD88)依赖性信号通路NF-κB的核转位和表达来减少流感感染的炎症反应[39,40]。有文献[41]报道，鼠麴草能够降低LPS刺激的NR8383细胞中的NO水平，同时降低TNF-α、IL-1β和COX-2的水平,以及降低NR8383细胞中磷酸化的p65和IκBα的水平。此外，利用该模型研究发现冬虫夏草菌丝体甲醇提取物可拮抗LPS诱导的NR8383细胞中p38和IκB磷酸化，下调p-p38和p-IκB水平，并阻滞LPS诱导的NF-κB的核转位，下调LPS诱导的iNOS和PGE2合成限速酶的高表达，对炎症反应表现出抑制活性[42]。

1.5 THP-1细胞模型

THP-1来源于急性单核细胞白血病患者的人单核细胞系，在一定剂量的佛波酯(PMA)诱导下成为成熟的THP-1巨噬细胞，由悬浮状转变为贴壁状，细胞形态由圆形转变为梭形、不规则形、椭圆形。当THP-1细胞受到LPS刺激后，THP-l细胞内NF-κB，MAPKs通路活化，p-ERK、p-p38、p-JNK、p-IKBα表达明显增加，相应的ERK、p38、JNK、IKB表达下降，并产生大量细胞炎症因子(IL-1β、 IL-6、IL-8和TNF-α)[43-45]。TNF-α作为细胞因子产生的诱导剂，其在10 pM的浓度下也可以诱导该细胞内NF-κB的活化[46]，因此，该细胞炎症模型可应用于药物的抗炎作用研究。

Wang等[47]以THP-1细胞为载体，研究荆芥挥发油抗炎作用及与NLRP3炎症小体激活相关的调控作用机制，发现荆芥挥发油能抑制ATP、Nigericin、CPPD 或CaCl2诱导的THP-1 巨噬细胞IL-1β高分泌，抑制ATP或Nigericin诱导下THP-1巨噬细胞裂解液中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表达，其抗炎作用的发挥与干预NLRP3炎症小体的激活有关。突尼斯木瓜果皮中的多酚提取物通过调节THP-1细胞中蛋白激酶B(Akt)、p38MAPK、NF-κB三种信号通路来达到抗炎效果的[48]。另有研究表明，丹参[49]中的紫草酸和丹酚酸B可显著下调LPS诱导的THP-1细胞中TLR4、p-p65和p-IκBα的表达[50]；白花丹参根提取中的丹参酮能显著抑制LPS刺激的THP-1细胞中的TNF-α、IL-1β和IL-8的mRNA[51]。该细胞具有更类似于人原代单核细胞的表型及功能特征，又具有比人原代单核细胞如外周血单个核细胞更广泛且稳定的来源和基因背景，故是迄今研究人原代单核细胞/巨噬细胞功能应用最普遍的体外模型细胞[52-54]。

2 中性粒细胞模型

中性粒细胞(neutrophil)来源于骨髓的造血干细胞，该细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关，在瑞氏(Wright)染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的(0.2～0.4微米)浅红或浅紫色的特有颗粒。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。嗜中性粒细胞被认为是急性炎症的中枢细胞，在发炎过程中，可明显观察到嗜中性粒细胞的数量、寿命、活动性、组织流入能力和吞噬能力的增加[55,56]。

多形核中性粒细胞(polymophnuclear leulocyte，PMN)是一种小吞噬细胞，在发挥防御作用时，其胞浆内的细胞毒性物质既可杀伤外来入侵的病原微生物，也可造成自身组织的损伤。其自发性凋亡的机制既避免了炎症反应扩大化，又减少了自身组织细胞损伤[57]。炎症反应发生时，其体内溶酶体以脱颗粒的形式释放多种酶，这些酶可被选择性的释放到胞外，其中最主要的为弹性蛋白酶。中性粒细胞弹性蛋白酶(enutorphil elastase，NE)即由中性粒细胞所释放，是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员，对炎症的发生及病原菌的清除具有重要作用。它为一种杂食性酶，可溶解多种蛋白，但最适底物是弹性蛋白。NE具有双重作用，生理条件下，NE参与调节炎性反应，促进吞噬细胞消除有害病菌，构成机体防御系统的重要部分。但是，炎症情况下，过量释放NE能降解胶原蛋白、层粘连蛋白和其他内皮组织的细胞外基质，增加组织通透性，促进中性粒细胞渗出，炎性因子释放，降解细胞基质，催化caspase-3诱导的细胞凋亡。NE的活性受到多种蛋白酶抑制剂的调控[58]。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(neutrophil elastase inhibitors，NEI)抑制NE活性，调节炎性细胞因子和趋化因子的释放，抑制炎细胞激活、跨膜迁移及组织毒性物质释放，发挥多层次的抗炎效应，并能调节机体先天免疫功能。因此，筛选具有NE抑制功能NEI的是发现具有抗炎活性的天然产物的有效手段。

Granica等[59]利用LPS刺激从人的血液中分离的中性粒细胞，建立了体外炎症模型，通过ELISA的方法，筛选出对口腔炎症(包括粘膜炎，牙龈炎和牙周病)具有显著疗效的天然成分——木水杨梅根的提取物及其主要成分水杨梅鞣质(gemin A)，并且发现gemin A通过减少黏附分子CD11b的表面表达，抑制活性氧和蛋白酶(弹性蛋白酶，MMP-9)，趋化因子和细胞因子(IL-8和 IL-1β)的释放，显著影响到由LPS刺激的嗜中性粒细胞的功能。此外，在Gomes等[60]人对N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)触发的嗜中性粒细胞进行体外趋化性的研究中发现，桃金娘烯醇相对于施用角叉菜胶的赋形剂组对细胞迁移有所改善，可阻止fMLP引发的嗜中性粒细胞趋化性。因此，建立中性粒细胞体外炎症模型，寻找有效的弹性蛋白酶抑制剂治疗炎症相关疾病，是一种有前景的方法。

3 其他类型细胞模型

3.1 P388D1细胞模型

小鼠淋巴瘤细胞(P388D1)来源于甲基胆蒽诱导形成的淋巴瘤，呈淋巴母细胞样，悬浮生长。在LPS和佛波酯的诱导下，该细胞可以产生IL-1和溶菌酶，并可以吞噬酵母多糖和乳胶微球。P388D1细胞可分泌弹性蛋白酶，胶原酶和纤溶酶原激活剂，其活性与体内炎性刺激引起的巨噬细胞活性相当。研究表明，抗炎性糖皮质激素可选择性和可逆的抑制P388D1细胞3种蛋白酶的分泌，但不抑制由该细胞产生的组成型溶菌酶的分泌。每个P388D1细胞约含有4 000个可饱和的糖皮质激素结合位点，糖皮质激素与P388D1细胞系之间的这种相互作用为建立基于中性蛋白酶分泌调节的巨噬细胞模型[61]提供了基础。

3.2 L929细胞模型

成纤维上皮细胞(L929)是从雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松结缔组织入脂肪组织中建立了亲本细胞系，经毛细管法分离单细胞而得到的。细胞贴壁生长，呈梭形或短梭形，细胞核呈圆形或卵圆形，核较小，单层生长，细胞质嗜弱碱性，集落清晰，形态分为致密型和疏散型两种[62]，并且增殖速度快，耐受力强，易接受转染。作为TNF-α细胞毒作用的敏感靶细胞，可用于筛选TNF-α的拮抗剂来研究抗炎药物。

Tian等[63]以LPS为刺激物建立L929细胞体外炎症模型，发现木瓜的乙酸乙酯部位具有良好的抗炎作用。在Oh等[64]的研究中，用干扰素-γ处理小鼠成纤维细胞L929细胞，继而导致过量的NO生成和iNOS基因表达，利用该模型筛选发现视黄酸可显著抑制NO生成和iNOS基因表达，并呈剂量依赖性，同时，9-顺式-视黄酸也会抑制NO的生成。另有研究发现，脂质体制剂对作为线粒体代谢评估的L929成纤维细胞活力具有正面影响，包埋脂质体的硫酸软骨素可有效降低H2O2刺激的L929成纤维细胞中TNF-α的产生并且具有与抑制IL-8相似的活性[65]。成纤维细胞增殖是组织再生伤口愈合中的重要步骤。心叶凹唇姜根茎的氯仿提取物可显著增强L929成纤维细胞生长，通过划痕试验，还观察到其乙醇提取物及其中组分对L929的迁移效果也显著增强，即心叶凹唇姜根茎的氯仿和乙醇部位可参与成纤维细胞的增殖和迁移，并刺激胶原蛋白的生产，且具有抗炎作用，是创伤愈合增强的重要因素[66]。此外，通过TNF-α诱导的L929细胞模型发现：竹黄抑制该模型COX-2蛋白的表达，并在一定浓度范围内诱导BCL-2表达上调，其中的有效成分主要通过COX-2、BCL-2信号途径影响TNF-α信号网络[67]。实际上，L929细胞是一株对TNF-α高度敏感的细胞株。从旋覆花中分离得到的倍半萜内酯二聚体可与TNF-α直接结合，选择性抑制TNF-α与Ⅰ型受体(TNFR1)的相互作用，在TNF-α刺激的细胞中有效地阻断TNFR1介导的信号，在体外拮抗TNF-α的促炎活性[68]，从而发挥抗炎作用。

3.3 小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3模型

NIH/3T3细胞是从Swiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触性抑制的胚胎成纤维细胞系，呈纤维细胞样，贴壁生长。该细胞对肉瘤病毒转化灶形成和白血病病毒的繁殖高度敏感，对DNA转化及转染研究十分有用，并且在基础医学和临床医学研究中较广泛的运用于各种外来因子对细胞的损伤或修复研究。TNF-α能刺激该细胞的增殖并能上调其中Syndencan-4蛋白的表达，介导炎症反应[69,70]。

从杏香兔耳风中分离得到的木犀草素、木犀草苷、绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二咖啡酰基奎宁酸五种中药单体可浓度依赖性降低细胞内PGE2的生成，且浓度越大，PGE2的含量越低[71]。有文献[72]报道，白藜芦醇是一种有效的组蛋白去乙酰化酶(Sirt1)激活剂，具有抗炎作用，利用该模型研究发现其抗炎活性主要依赖于Sirt1和Sirt1对炎症产生负面调节而发挥作用。

4 结论

炎症是身体对于有害的刺激和条件引起的适应性反应。在生理条件下，炎症能够消除感染、修复机体，可防止进一步的损伤；在病理条件下，炎症可导致组织破坏和器官功能障碍，这在许多人类疾病的发展中起着重要作用。炎症是先天免疫系统对有害刺激，组织损伤或感染的复杂生物反应，其特征在于热、肿胀、发红、疼痛和功能障碍[73]。然而，慢性炎症已被认为是包括动脉硬化、神经退行性疾病、哮喘和癌症在内的多种疾病的常见原因[74-77]。

很多天然药物具有良好的抗炎效果，且资源丰富、副作用小、应用历史悠久，因此具有很好的开发价值和前景，选择合适的筛选模型尤为重要。由于动物模型筛选抗炎药物存在规模小、成本高、耗时长，尤其是对样品的需求较大等不利因素，而细胞模型快速、高效、成本低，且能对药物作用的分子靶点及机制做出解释，因此细胞模型在筛选抗炎药物的过程中显得极其重要。以往的综述主要集中在天然药物的抗炎机制方面，但有关抗炎天然药物细胞筛选模型的总结很少有报道，本文综述了近年来在抗炎药物筛选过程中应用的一些细胞模型，以期为天然药物的抗炎活性及机制研究提供参考。