P TEN基因不同表达黑色素瘤模型小鼠T淋巴细胞亚群检测及意义

孙 旭 李 宁 张旭东 杨月美 白冰清

黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的肿瘤，近年来已经成为发病率增长最快、死亡率最高的肿瘤之一[1]。随着分子免疫学的飞速发展，学者们逐渐了解到黑色素瘤的发生发展与患者的免疫功能密切相关[2]。T 淋巴细胞各种亚型的数量及活性是机体免疫功能状态的重要体现[3]。第 10 号染色体同源缺失性磷酸酶－张力蛋白（PTEN）作为一种抑癌基因，它的正常表达可以影响宿主的免疫反应[4]。PTEN 失活可出现在多种肿瘤组织中，参 与肿瘤的发生、发 展过程[5]。本研究通过检测 T 细胞亚群的数量和比例，探索 PTEN 在黑色素瘤免疫逃逸中的机制。

资料和方法

健康C57BL/6小鼠74只，8～10周龄体重16～20 克，雌性，购自河北省实验动物中心（许可证号SCXK（冀）2017-1-0008）。（PTEN+/+-B16F10）细胞株、（PTEN-/--B16F10） 细胞株 （上海中桥新舟公司）。FITC Anti-mouse CD3（美国Tonbo Biosciences公 司 ）；FITC Anti-mouse CD4 （美国Tonbo Biosciences 公司）；PE Anti-mouse CD8（天津三箭生物技术股份有限公司）；PE/Cy5 Anti-mouse CD28（天津三箭生物技术股份有限公司）。

建立PTEN不同表达的荷瘤小鼠模型：将PTEN+/+-B16F10，PTEN-/--B16F10 细胞（图 1、2）分别皮下接种同系 C57BL 小鼠，实验动物随机分为三组（A＝24；B＝25；C＝25）：A 组注入 0.2ml 的 RPMI-1640培养液；B组注入0.2ml浓度为4×106/ml 的（PTEN+/+-B16F10）；C组注入0.2ml浓度为4×106/ml的（PTEN-/--B16F10）。模型建立成功的标准：B 组、C 组小鼠背部可见直径约为5mm大小黑结节，突出皮肤表面。分别 B、C 组各取一只动物，取肿瘤组织免疫印迹法检测 PTEN 表达情况。

图1 倒置荧光显微镜下观察 PTEN+/+-B16F10 细胞（×100）a：培养三天的细胞图像，b：胰酶消化后的细胞图像。

图2 倒置荧光显微镜下观察 PTEN-/--B16F10 细胞（×100）c：培养三天的细胞图像，d：胰酶消化后的细胞图像。

免疫细胞表面分子染色：接种肿瘤细胞第7天（D7）开始，每隔5天，随机选取 A、B、C组各6只小鼠。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉剂量为 0.3ml/100g 体重，麻醉起效后处死，设计腹腔切口，无菌分离脾脏，EP 管中剪碎，研磨，冲洗，收集细胞，红细胞裂解液裂解红细胞2分钟，1200r/min 离心10min 后弃去上清，重悬，计数。准备18支流式管，分3组，每组6支，对应加入细胞，数量约 1×107个，体积 100 微升，将 CD3、CD4、CD8、CD28 抗体进行免疫标记反应，避光染色 30min。细胞染色缓冲液离心洗涤2次，1000r/min，10min，充分混匀、避 光30min，PBS 重悬100～200 微升，操作均在 4℃冰盒上进行。

流式细胞仪检测：EPICSXL 流式细胞仪对制备好的流式样本上机检测。测定各亚型淋巴细胞表面各种荧光素的荧光强度，荧光强度以二维 dot-plot散点图储存于电脑中。自动分析结合某一单抗的阳性细胞个数和百分比得到 CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+/CD8+百分数。检测结果采用 FlowJo software软件进行分析。

结 果

1.细胞生长情况：培养3天的PTEN+/+-B16F10细胞、PTEN-/--B16F10 细胞可见呈梭形，随着时间的延长，细胞棱角变顿，细胞贴于无菌培养瓶底。培养7～8 天后，可见细胞已铺满瓶底，胰酶消化后细胞收缩成颗粒、球状、可活动（图 1、2）。

2.实验组小鼠模型建立和鉴定：接种肿瘤细胞第 7 天，可见 B 组、C组小鼠背部均触及直径约为5mm 大小黑结节，突出皮肤表面，成瘤率 100%。提取肿瘤组织蛋白免疫印迹检测鉴定 B 组小鼠肿瘤标本 PTEN 蛋白表达，C 组小鼠不表达，成功构建荷瘤小鼠模型（图 3）。

图3 荷瘤小鼠 PTEN 的表达

3.CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+T细胞表达（表1、表2、表3、表4）：对照组（A 组）小鼠脾脏组织中CD3+T、CD4+T 比例及数量随着时间的延长呈下降趋势，D7、D12、D17 组内比较（P＞0.05），分别与 D22比较 （P＜0.05）。CD8+T、CD28+/CD8+比例及数量随着时间的延长基本平稳（P＞0.05）。两组荷瘤小鼠脾脏组织中 CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+/CD8+比例及数量随着肿瘤的增长降低，D7、D12，C 组 ＜B 组，（P＞0.05）；D17、D22，C 组＜B 组（P＜0.05）；B 组 、C组各时间点组内比较 （P＜0.05）。B 组下降幅度：CD3+T 为 79.8% 、CD4+T 为 82.6% 、CD8+T 为 65.37%、CD28+/CD8+为 58.69%。C 组下降幅度：CD3+T为 89.62% 、CD4+T 为 89.24% 、CD8+T 为 84.85% 、CD28+/CD8+为 70.53%。对照组与荷瘤组比较各个时间点 B 组＜A 组；C 组＜A 组（P＜0.05）。

表1 各组小鼠脾脏组织中 CD3+T 淋巴细胞相对

表2 各组小鼠脾脏组织中 CD4+T 淋巴细胞相对数量

表3 各组小鼠脾脏组织中 CD8+T 淋巴细胞相对数量

表4 各组小鼠脾脏组织中 CD28+/CD8+T 细胞比例

讨 论

黑色素瘤是来源于黑色素细胞的肿瘤，目前免疫治疗是晚期患者的主要治疗方法但是存在效果不明显而限制其应用[6]。近年来学者发现大量的肿瘤抗原尤其是 T 细胞识别的肿瘤抗原，在细胞和分子学水平探索肿瘤与免疫系统相关性[7]。PTEN 是 1997年由美国三个独立研究小组在人类第 10 号染色体上发现的一种具有双特异性磷酸酶活性强大的的肿瘤抑制基因。肿瘤细胞的快速生长、浸润及转移与肿瘤微环境以及肿瘤细胞通过自身的改变适应机体内环境来逃避免疫系统的识别或攻击有着密切的关系[8]。

大量研究表明T淋巴细胞参与的细胞免疫与肿瘤的发生发展关系密切[9]。T 淋巴细胞作为重要的免疫应答者，参与具有免疫原性肿瘤细胞的生长并发挥自身的调控作用，其亚群的功能也一直是学者们研究的重点[10]。T 细胞表达 MHC Ⅰ类抗原，同时还表达多种分化抗原 CD 分子。T 细胞缺陷会激 活机体免疫，肿瘤的发生使得免疫系统对肿瘤应答，而肿瘤本身通过免疫消除、相持、逃逸来逃避机体的免疫监视[11]。T 细胞的数量变化可以体现肿瘤发生 发展的情况。研究表明 CD8+CTL 细胞是一种能够特异性杀伤性 T 细胞，而后学者发现 CD28 是一种特异性表达 CTL 细胞的效应细胞[12]。本研究表明：CD 分子作为 T 细胞的表面抗原，其数量和比例可以反 映出机体对于外界刺激的反应，尤其是肿瘤形成对免疫力的影响。在正常小鼠体内，随着时间的延长CD3+T 细胞、CD4+T 细胞数量均出现下降的趋势，表明随之时间的延长，小鼠免疫力逐渐下降。两组荷瘤小鼠脾脏组织中各指标组内比较均有显著性差异。考虑当肿瘤生长到一定程度后，在与机体的对抗中，严重的破坏了自身免疫状态和内环境，这也与后期肿瘤体积增大一致，因肿瘤的存在，抵抗力明显降低。PTEN 基因缺失使得小鼠抵抗肿瘤的免疫 力降低，而这种作用在肿瘤发生初期表现不明显，随之肿瘤的增长，PTEN基因参与机体抵抗肿瘤过程作用凸显，基因缺失使得肿瘤细胞得以免疫逃逸。随着时间延长，小鼠机体免疫应答持续进行，且在后期机体防御系统呈现弱势，当机体面对肿瘤发生时，表现 CD 分子表达减弱明显，机体免疫力减低地更快。