蒲公英黄酮类醇提物对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

桑利升,吴 杰,曹雅杰,白 雪,包晓红,2,*

(1.锦州医科大学基础医学院,辽宁锦州 121000;2.台州学院医学院,浙江台州 318000)

食管癌是世界第六大癌症死亡原因[1]。我国食管癌发病和死亡病例均约占全球的50%,尤其是在中西部农村高发区,食管癌仍是当地居民的主要疾病负担[2]。食管癌分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌,我国以食管鳞状细胞癌为主。手术是早期食管癌临床治疗中最有效的方式之一,但食管癌早期症状常不明显[3],当在诊断时,有一半的患者存在转移性疾病,而局部区域性疾病的患者在大多数病例中发展为转移性疾病[4]。对于已失去手术根治机会的中晚期食管癌,化疗为其主要姑息治疗方案[5]。顺铂联合5-氟尿嘧啶(DF化疗方案)是临床治疗中晚期食管癌的重要选择,但受个体差异等因素影响,该方案仍难使部分患者有效获益[6]。目前,中药提取物对癌症的治疗成为热门,因中药纯天然、副作用少,其提取分离的有效成分在生物活性方面具有明显优势,主要表现在术后免疫力提高、放化疗副作用减轻、肿瘤复发抑制和转移减少等方面,这为提高患者的生活质量并对生存期的延长有显著的影响[7]。现已有临床研究对卵巢癌晚期患者用中药进行治疗,并且已取得良好的治疗效果[8]。目前紫杉醇、长春新碱等已经成为临床常用的植物化疗药,例如三七总皂苷(PNS)在动脉粥样硬化、糖尿病、急性肺损伤、癌症和心血管疾病等医学研究或应用中得到了广泛的应用[9]。此外,各种PNS制剂如注射剂和胶囊,已经商品化,并在临床实践中得到了广泛的应用[10]。

癌细胞的特征是活性氧含量升高,活性氧主要由线粒体产生[11]。当细胞受到一定的有害刺激时,体内的活性氧自由基(ROS)以及活性氮自由基(RNS)等一些高活性的生物分子迅速大量形成,可以诱导组织损伤以及细胞凋亡,存在于动、植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)具有消除ROS的功能。黄酮具备类SOD的作用,这些成分能有效清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基和抑制不饱和脂肪酸的氧化[12]。在现有的研究中,对银杏中的黄酮类物质的研究最充分,其中抑制新生血管的生成和抗自由基是预防和抑制肿瘤细胞的生长和扩散的重要途径[13]。蒲公英含有丰富的黄酮,具有较强的清除自由基、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、细胞保护作用,以及抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理作用[14]。蒲公英提取物对乳腺癌、宫颈癌、肝癌等中的治疗有相关报道,且治疗效果良好[15-17]。但在食管癌治疗中的研究报道尚少。因此,本研究探究蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞增殖、细胞迁移和侵袭的影响,初步分析药物对细胞迁移和侵袭的作用机制,旨在为食管鳞癌的防治提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

人食管鳞癌细胞(ESCC)株KYSE30、TE-1 南京科佰生物科技有限公司;蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)干样 杭州修正药店;RPMI1640培养基 美国Hyclone公司;标准胎牛血清 美国Gemini Bio;青霉素-链霉素混合溶液 北京Solarbio;胰蛋白酶消化液、CCK-8 北京鼎国昌盛有限公司;BCA定量试剂盒 美国Thermo Scientific公司;抗兔E-Cadherin多克隆抗体、抗兔ZO-1多克隆抗体、抗兔N-Cadherin多克隆抗体 美国Proteintech公司;抗兔Snail-1多克隆抗体 武汉爱博泰克公司;抗鼠β-actin 多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG HRP 上海优宁维公司;山羊多克隆抗体二抗to小鼠IgG-H&L 英国abcam公司;ECL 发光液、结晶紫 上海碧云天生物技公司;transwell板、Matrigel基质胶 美国康宁公司。

Thermo HERA cell1 50i/240i CO2细胞培养箱 美国Thermo公司;BioTek Synergy H1酶标仪 美国BioTek公司;GE Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪 美国GE公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 蒲公英黄酮类醇提物的获取 蒲公英干样利用醇沉法超声波提取蒲公英黄酮[18],其乙醇质量分数为50%,提取温度为40 ℃,提取时间为2 h,黄酮含量为6.32%。蒲公英黄酮类醇提物浓度为0.0249 mg/L。

1.2.2 细胞培养 KYSE30和TE-1细胞培养于含10%胎牛血清和青-链霉素各100 U/mL RPMI1640培养基,于37 ℃ 5% CO2恒温加湿培养箱中培养。用显微镜观察细胞形态及生长情况,待细胞长至对数生长期时用于后续实验。

1.2.3 细胞增殖能力检测 消化收集细胞,以5×103cell/孔接种于96孔板,放入培养箱中培养24 h。加入100 μL含不同浓度(0、0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL)的蒲公英黄酮类醇提物的培养基,每个浓度设4个复孔,继续培养24、48、72 h。每个时间段每孔加入20 μL CCK-8,37 ℃孵育3 h,酶标仪上测定450/630 nm处吸光度(A)值,计算其生存率。生存率(%)=加药组A值/未加药组A值。

1.2.4 细胞迁移能力检测 细胞以5×105cell/孔浓度接种于6 孔板,于37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育过夜。用移液器吸头在中间区域划痕,弃去培养基并用PBS洗去划掉的细胞,于倒置显微镜下拍照。配制含蒲公英黄酮类醇提物浓度为0(对照组)、0.1、0.5 μg/mL的无血清培养基,加入细胞中继续培养24 h,显微镜倍数下100倍拍照记录细胞迁移情况。实验重复3次。用Image J计算划痕面积。

迁移率(%,以12 h为例)=(0 h划痕面积-12 h划痕面积)/0 h划痕面积×100

1.2.5 细胞侵袭能力检测 将matrigel基质胶从-20 ℃冰箱中取出置于4 ℃待其融化,按照1∶20比例用不含血清的OPTI-MEM培养基稀释后放入Transwell小室中置于37 ℃培养箱1～2 h待固化。将Transwell上室加入100 μL含5×104cell的无血清细胞悬液和100 μL含不同浓度(0、0.1、0.5 μg/mL)的蒲公英黄酮类提取物的无血清培养基,下室加入500 μL含10%血清的培养液,放置于细胞培养箱中培养。48 h后取出小室,经固定、结晶紫染色后在400倍显微镜下随机选取5个视野照相,观察和计算细胞穿过膜的数量。实验重复3次。用Image J计算侵袭细胞数。

1.2.6 Western Blot检测侵袭相关蛋白的表达 细胞以3×105cell/孔浓度接种于6孔板放置培养箱中孵育过夜。不同浓度的蒲公英黄酮类醇提物(0、0.1、0.5、1.0 μg/mL)处理KYSE30和TE-1细胞48 h后,去除培养基,PBS洗涤后,再加入细胞裂解液(含PMSF),冰上放置1 min后12000 r/min、4 ℃离心5 min,取上清。BCA法测其浓度,等量蛋白样品经4%～10%(w/V)不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转移至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉TBST封闭液封闭2 h,一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜,一抗有:E-cadherin(135 kDa)、N-cadherin(140 kDa)、ZO-1(220 kDa)、Snail-1(29 kDa)和β-actin(42 kDa),以β-actin做对照,TBST清洗3次,每次10 min。再加二抗(1∶10000)室温孵育1 h,TBST清洗3 次,每次10 min。最后用ECL显色液进行显色,拍照。使用Image J软件分析条带灰度值。相对表达量(%)=(各蛋白灰度值/β-actin 灰度值)×100。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞增殖的影响

已有研究发现,蒲公英能够抑制肝癌细胞的增殖[19]。不同浓度的蒲公英黄酮类醇提物处理ESCC细胞0～72 h后,测细胞的增殖情况,如图1所示,0.1 μg/mL蒲公英黄酮类醇提物短时间(48 h)内促进TE-1细胞增殖,对KYSE30细胞仍起抑制作用,但从0.5 μg/mL浓度开始,细胞生存率明显下降,浓度高至5 μg/mL时细胞生存率低于20%。这证明蒲公英黄酮类醇取物对食管鳞癌细胞KYSE30和TE-1具有明显的抑制作用,两种细胞在蒲公英黄酮类醇提物的作用下都出现了增殖减慢,且都呈现出一定的浓度依赖关系。蒲公英黄酮类醇提物对食管鳞癌细胞尤其对KYSE30细胞显著呈现浓度和时间的依赖关系(P<0.0001)。这种现象可能与黄酮醇取物中的槲皮素等成分有关[20]。有报道认为黄酮能通过非cGMP依赖途径抑制人食管癌细胞的增殖并且可能通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达而诱导食管癌细胞发生凋亡[21-22],因此猜测蒲公英黄酮可能也通过类似的途径抑制细胞增殖并且增加凋亡。

图1 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞增殖的影响Fig.1 Effect of flavonoids extract from dandelionon the proliferation of ESCC cells注:与对照组相比,****表示加药组差异高度显著,P<0.0001;***表示加药组差异非常显著,P<0.001;**表示加药组差异显著,P<0.01;*表示加药组差异显著,P<0.05;图2～图4同。

2.2 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞迁移能力的影响

迁移是肿瘤细胞转移过程中必不可缺的环节之一。肿瘤细胞在迁移刺激物的作用下,产生趋化性及趋触性迁移,完成向远离器官的转移[23]。用不同浓度的蒲公英黄酮类醇提物处理KYSE30和TE-1细胞24 h,其迁移能力随着浓度的增加而下降,如图2。对照组(0 μg/mL)细胞经过24 h的无血清培养基培养后划痕面积已合拢一半,0.1 μg/mL浓度处理时的KYSE30和TE-1细胞的迁移率分别为19.33%和22.66%(P<0.001),0.5 μg/mL浓度处理时的KYSE30细胞基本迁移率不变,而TE-1细胞迁移率降至18.32%(P<0.01)。因此,蒲公英黄酮类醇提物可有效抑制ESCC细胞迁移,尤其对KYSE30细胞,效果更加明显,且都呈现出一定的浓度依赖关系。

图2 蒲公英黄酮类醇取物对ESCC细胞迁移的影响Fig.2 Effect of flavonoids from dandelion on the migration of ESCC cells注:A和B分别为KYSE30和TE-1的迁移率。

2.3 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞侵袭能力的影响

肿瘤的侵袭是恶性肿瘤的主要生物学特征,也是影响治疗结果和预后的重要因素。用不同浓度的蒲公英同类药物处理KYSE30和TE-1细胞48 h,其结果如图3。对照组细胞经48 h大部分已侵袭过膜,而0.1 μg/mL浓度药物处理后,与对照组相比,只有40.25% KYSE30细胞和51.00% TE-1细胞穿透过膜(P<0.0001),0.5 μg/mL浓度的药物侵袭能力已大幅降低(KYSE30:68.88%,TE-1:85.46%)(P<0.0001),说明蒲公英黄酮类醇提物抑制食管癌细胞侵袭能力,且呈剂量依赖性。

图3 蒲公英黄酮类醇提物对细胞侵袭能力的影响Fig.3 Effect of flavonoids extracts of dandelion on the invasion ability of cells 注:A:KYSE30细胞;B:TE-1细胞。

2.4 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞侵袭相关蛋白的影响

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一种发生在多种疾病中的病理过程,与肿瘤的进展有较大的关系。在EMT发生过程中,上皮细胞失去其基底细胞的极性及细胞与细胞之间的粘附性,获得间质细胞更易侵袭转移的表型,同时细胞失去上皮细胞标志物,如E-钙黏着蛋白(E-cadherin),而表达间质细胞标志物如N-钙黏着蛋白(N-cadherin)[24]。EMT受到多重水平的调节,主要是转录后的修饰,一些转录因子包括Twist、snail家族等可以触发EMT进程,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移[25]。为了检测药物影响细胞的侵袭转移能力的机制,用不同浓度的蒲公英同类药物处理KYSE30和TE-1 48 h,通过Western Blot法检测侵袭迁移相关蛋白(图4)。随着药物浓度的增加,KYSE30细胞相比对照组E-cadherin表达量增加120%(P<0.001),N-cadherin减少38%(P<0.01),Snail-1和ZO-1表达量分别减少35%(P<0.01)和23%(P<0.05);而TE-1细胞相比对照组E-cadherin表达量增加114%(P<0.05),N-cadherin减少65%(P<0.01),Snail-1和ZO-1表达量分别减少85%(P<0.01)和53%(P<0.05),表示蒲公英黄酮类醇提物通过上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin、Snail-1和ZO-1蛋白表达,从而有效抑制肿瘤细胞EMT和转移。黄酮类化合物同MAPK抑制剂效果相同,都能通过抑制MAPK信号通路而抑制EMT[26]。

图4 蒲公英黄酮类醇提物对ESCC的迁移和侵袭相关蛋白的影响Fig.4 Effects of flavonoids extracts from dandelion on migration and invasion related proteins of ESCC cells注:A和B分别为蒲公英黄酮类醇提物对ESCC细胞侵袭的相关蛋白的影响;C和D分别为KYSE30和TE-1的相关蛋白的与Actin表达量比较之后的相对表达量。

3 结论

本研究通过细胞CCK-8、划痕和transwell实验均证实,蒲公英黄酮类醇提物处理食管鳞癌细胞后,均出现明显的抑制细胞生长,迁移和侵袭现象,且都呈现出一定的浓度依赖关系,这种现象可能与黄酮醇取物的某些化学成分有关。蒲公英黄酮类醇提物通过上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin、Snail-1和ZO-1蛋白表达,从而有效抑制肿瘤细胞EMT和转移。ERK是MAPK家族的一员,是细胞生长和分化调控的主要参与者。然而,当不适当地激活时,它会导致恶性转化。ERK信号通路可以改善EMT在体内和体外模型中的表达[27]。因此,蒲公英黄酮类醇提物调节EMT的机制可能与ERK信号通路有关。

综上所述,蒲公英黄酮类醇提物有效抑制食管鳞癌细胞增殖,迁移和转移侵袭能力,为后期活性成分的提取和新药开发提供了实验依据和理论基础,也为食管癌的中药物治疗提供有效的实验数据。