从化地区儿童人冠状病毒流行病学与临床特点的观察

李柏谦 李鉴州 李海萍

广州市从化区妇幼保健院儿科(广州 510900)

人冠状病毒OC43((human coronavirus OC43，HCoV-OC43))是冠状病毒科的一种，是有包膜的单正链RNA病毒，在RNA病毒中具有最大的病毒基因组[1]。在人类中，冠状病毒被证明可引起呼吸道感染，最常见的是上呼吸道感染，也可引起下呼吸道感染，也可以引起严重的呼吸系统疾病，包括严重的急性呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)和中东呼吸综合症(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)[2]。到目前为止，已经鉴定出六种HCoV类型，包括OC43、229E，NL63，HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV[3- 4]。HCoV-OC43和HCoV-229E是最早些年被发现，主要引起人类普通感冒，据报道，最近几年又发现的NL63和HKU1引起轻度呼吸道感染，这四种冠状病毒也可以引起严重的下呼吸道感染，在患有基础疾病的幼儿或老年人中[5]。HCoV-NL63与急性喉气管炎有关[6]。SARS-CoV是一种2bβ冠状病毒，导致严重的下呼吸道感染，高发病率和死亡率[7]。新型冠状病毒MERS-CoV，它是一系列高致病性、高死亡率(20%～40%)的下呼吸道感染的病原体，主要是中东地区的流行病，但在2014年又在韩国爆发[8]。冠状病毒由于其重组，变异和感染多种物种和细胞类型的能力而可能引起高暴发，因此，它们具有在物种间跳跃的倾向[9- 10]。到目前为止，没有针对冠状病毒的抗病毒疗法，只有少数选择预防冠状病毒的感染。因此对HCoV流行病学的监测和了解HCoV流行病学特征，对于HCoV感染的预防和控制非常重要。我们收集2017年1月—2019年6月期间在从化地区妇幼保健院门诊就诊的有呼吸道感染症状的儿童610例，进行咽喉和鼻拭子标本采集，并观察呼吸道感染的多种病毒的流行病学特征和冠状病毒基因特点，对临床早期诊断和合理用药具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择病例为2017年1月—2019年6月就诊于广州市从化区妇幼保健院儿科门诊，诊断为急性上呼吸道感染和下呼吸道感染的患儿，共610例, 其中男390例，女220例。年龄在6月—14岁之间，610例患儿按年龄分为：婴幼儿组(6月～3岁)415例，儿童组(3岁～14岁)195例，共2个年龄组。本研究经医院伦理委员会批准，所有儿童或者父母得到书面知情同意书。

1.2 入组标准

样本取自发热≤4d(温度≥37.5℃)且有鼻塞、流涕、咽痛、咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困难和/或其他急性呼吸道感染症状的个体。经临床确诊为上呼吸道感染(急性咽炎、急性鼻炎、急性扁桃体炎)，下呼吸道感染(急性支气管炎、支气管肺炎)，其中急性咽炎68例、急性鼻炎53例、急性扁桃体炎106例；急性支气管炎268例、支气管肺炎115例，诊断标准：参照《诸福棠实用儿科学》第8版[11]。排除标准：年龄小于6个月和大于15岁儿童；严重心脏病患者；肺炎感染引起的并发症患者；严重精神疾病患者。

1.3 标本收集

标本采集与检测用植绒鼻咽拭子从患者的鼻咽部取样，将鼻咽拭子放入无菌储存管中(含2mL生理盐水)，立即送检。采用直接免疫荧光法检测：流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)，共7种呼吸道病毒抗原。采用荧光定量PCR方法，对HCoV-OC43病毒核酸进行分析和测序，同时对冠状病毒的亚型也进行检测，包括：HCoV-OC43，HCoV-229E， HCoV-NL63，HCoV-HKU1。

1.4 RT-PCR检测冠状病毒

按照试剂盒的说明操作，使用QIAamp MiniElute Virus Spin(德国QIAGEN)从200μL的喉咙和鼻拭子样本中提取病毒DNA和RNA。使用Thermo Scientific Revert Aid First绞链cDNA合成试剂盒(Thermo，USA)进行病毒RNA的反转录，过程为：25℃5min，42℃60min，然后70℃5min。cDNA可立即用于病毒检测，或保存在-20℃下直至进一步使用。通过标准逆转录PCR(RT-PCR)检测冠状病毒，筛选HCoV和4种(OC43、229E，NL63，HKU1)。TaqMan实时PCR引物和探针(由Invitrogen，Life Technology，上海合成)被设计为结合高度保守的HCoV区域和相应物种，并通过Primer Express软件(3.0版，美国应用生物系统公司)进行分析(用于引物)。每个反应混合物由10μL2×iQ Supermix反应混合物(Bio-Rad)，2μL病毒cDNA，0.5μM正向和反向引物以及0.3μM探针和无核酸酶的水组成体积为20μL。对于总HCoV，实时PCR在95℃下进行5min，然后在95℃下进行45次循环15s，在60℃下进行1min。对于物种229E / OC43/ NL63/ HKU1，在95℃下进行5min实时PCR，然后在95℃下进行45次循环15s，在55℃下进行1min。然后进行45个循环，分别是95℃持续30s，55℃15s，60℃45s。所有实时PCR反应均在ABI7500实时PCR系统(美国Applied Biosystems)上进行。用于反应的引物如下，见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 HCoV-OC43 N基因的扩增和测序

对于HCoV-OC43的N基因测序和系统发育分析，通过Primer Premier 5.0软件设计了3对引物，以结合相对保守的N基因区域。用于设计引物的参考序列包括GenBank数据库中可用的来自不同地区和年份的15种代表性菌株。它们的GenBank登录号为：NC_005147.1，AY585229.1，AY585228.1，KF530099.1，KF530098.1，KF530097.1，KF530096.1，KF530095.1，KF530093.1，KF530091.1，KP198611.1， KJ958218.1，JN129835.1，L14643.1和Z21849.1。引物是由中国上海的Invitrogen公司合成的。在准备的20 μL反应混合物中进行PCR，该混合物包括10 μL 2×Premix Ex Taq(Takara，大连，中国)，2 μL模板cDNA，正向和反向引物各0.5 μmol。PCR程序为：95℃持续5 min，然后进行35个循环：95℃持续30 s，50℃至55℃(有关不同引物的解链温度，请参见表1)1 min和72℃ 1 min，最后在72℃延伸10 min。用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(中国大连，Takara)纯化用于测序的PCR产物，并将其克隆到PMD19-T载体(中国大连，Takara)中。用于克隆和测序的所有PCR产物均来自三个独立的PCR反应。测序由中国上海的Invitrogen公司进行。用于测序的引物见表2。

表2 用于HCoV-OC43 N基因扩增和测序的PCR引物

1.6 病毒检测 选用美国 Chemieon公司产品，采用直接荧光免疫法，对流感病毒 A、B型(influenza virus,IVA、B)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型 (parainfluenza virus, PIVⅠ、Ⅱ和Ⅲ)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(adenovirus, ADV)共七种常见呼吸道病毒进行检测，通过奥林巴斯BX51荧光显微镜, 按试剂说明标准操作，观察判断结果 。

2 结 果

2.1 患者呼吸道感染病毒类型分布

参与观察的610例患者中，其中男390例，女220例。婴幼儿415(68.03%)例，平均年龄(2.15±0.27)岁，其中男婴280例，女婴135例。儿童195(31.97%)例，平均年龄(9.68±4.65)岁，其中男童110例，女童85例。各种常见病毒的发病情况，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠状病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多为流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠状病毒感染最低68例(11.14%)。见表3。

2.2 冠状病毒HCoV各月份阳性率分布

统计2017—2019年总的HCoV的月份分布，可以看出，HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物种之间存在差异。HCoV-OC43全年均可检出，春季(4月和5月)检出率较高，冬季较低 。HCoV- 229E的流行高峰出现在2月，而其余月份的检出率则要低得多。HCoV-NL63阳性率主要在夏季(7- 8月)和冬季(12月)检出。HCoV-HKU1阳性率的高峰出现在1月至2月，不同月份的检测率也存在差异。见表4。

2.3 冠状病毒 HCoV核苷酸分析突变位置

我们在一些样品中发现了核苷酸突变。N基因型的OC43冠状病毒中有6个在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置(参考菌株的Genbank登录号：KF923904.1)中共有11个碱基的取代。发现基因型B的8种HKU1冠状病毒中有6种在基因组的核苷酸位置24,465处有额外的插入，导致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“苏氨酸”插入(Genbank登录号为DQ415911.1)。见表5。

表3 儿童呼吸道感染病毒类型的分布 例(%)

表4 儿童呼吸道感染的HCoV及其亚类月份的分布

表5 基因型N蛋白氨基酸位点突变分析

3 讨 论

近年来，病毒研究的不断进步和发展, 发现致呼吸道疾病的病毒种类越来越多,需要用病原诊断作为治疗依据, 来指导呼吸系统感染性疾病的药物选择, 防止病毒对其他重要脏器的损害，合理用药, 为避免滥用抗生素提供重要依据，具有重要的临床意义。冠状病毒(CoV)主要指人冠状病毒(HCoV)是已知自然界中最长序列RNA病毒，能够引起人类和动物呼吸道、消化道和神经系统感染。20世纪60年代发现的HCoV-OC43和HCoV- 229E多引起普通感冒，而SARS-CoV 及MERS-CoV的暴发流行也引起人们对HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1的再次关注。HCoV感染可见于成人、小年龄儿童及新生儿。HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1临床多表现为亚临床感染和轻度呼吸道感染，但在儿童、老年人、免疫功能抑制等人群中可致重症呼吸道感染。研究表明在呼吸道感染的住院患儿中这4 种HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1呈全年散发，流行季节不明显。国内外研究显示，在下呼吸道感染的住院患儿中HCoV的检出率较低，占5.5%～7.9%，本研究中HCoV的检出率也较低为11.14%。各种常见病毒的发病率，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠状病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多为流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠状病毒感染最低68例(11.14%)。

在SARS冠状病毒爆发之前，冠状病毒被认为会引起人类轻度，自限性呼吸道感染[12]。但是SARS-CoV和MERS-CoV的出现改变了人们的认识。 SARS-CoV的高致病性引起了对该病毒家族的新的关注，对SARS-和MERS-CoV起源的进一步研究表明冠状病毒变异的可能性以及从动物宿主到人类的传播[13- 14]。因此，对人以及动物冠状病毒的监测对于HCoV变异研究和感染控制非常必要且重要[15]。然而，据我们所知，从化地区的HCoVs分子流行病学报道非常有限，关于HCoV的变异报告很少。因此，在这项研究中，我们调查了从化地区儿童急性呼吸道感染症状的HCoV的分子流行病学特征，并对HCoV最普遍的种OC43的N基因进行了基因型分析，并观察到新型OC43基因型N的流行情况。

我们在2017年1月—2019年6月，收集了610例急性呼吸道感染症状患者的咽喉和鼻拭子，检测冠状病毒和其他7种常见呼吸道病毒，RT-PCR方法用于HCoV检测，以提高灵敏度并避免交叉污染和假阳性。与使用传统PCR进行HCoV筛查相比，RT- PCR方法灵敏度更高可能有助于HCoV的检出率更高，并且可能是在HCoV监测中更好的方法。但是，由于HCoV的检出率在不同的地区和国家中有所不同，所以检出率不同的另一个原因也可能在于区域分布。我们共检测到4种HCoV物种，包括HCoV- 229E，OC43，NL63和HKU1，未检测到SARS-CoV和MERS-CoV，说明从化地区高致病性SARS-CoV和MERS-CoV没有传播到本地。在本地流行的HCoV中，最常见的是OC43，其次是229E和NL63，而HKU1的检出率最低。

我们发现从月度分布HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物种之间存在差异。HCoV-OC43全年均可检出，春季(4月和5月)检出率较高，冬季较低。HCoV- 229E的流行高峰出现在2月，而其余月份的检出率则要低得多。HCoV-NL63阳性率主要在夏季(7～8月)和冬季(12月)检出。HCoV-HKU1阳性率的高峰出现在1月至2月，不同月份的检测率也存在差异。在已有的报道研究中可以发现类似的现象，该研究有2年的数据[16]。因此，连续监测的数据对于揭示HCoV流行病学的模式非常重要[17]。我们在一些样品中发现了核苷酸突变。N基因型的OC43冠状病毒中有6个在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置中共有11个碱基的取代。发现基因型B的8种HKU1冠状病毒中有6种在基因组的核苷酸位置24,465处有额外的插入，导致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“苏氨酸”插入。该地区冠状病毒HCoV- 0C43具有很大的临床多样性，与国内已发表的菌株HCoV- 0C43相比具有很高的同源性，同源性达97%～100%。

综上所述，我们的结果表明，冠状病毒OC43的检出率与以前的报道相符，未发现新的传染性冠状病毒，冠状病毒的流行趋势稳定，所有感染者均表现出轻到中度的呼吸道感染症状。HCoV-OC43春季(4月和5月)检出率较高，冬季较低。由于本研究时间较短，阳性病例数较少，因此，需积累更多的资料，更好地了解其在儿童急性呼吸道感染中的作用。