PAR-1受体拮抗剂及激活剂对apoE基因敲除小鼠血清CRP、IL-18和IL-10的影响

华光耀,张小勇,黄超龙,刘晓剑,邱敏,张国奇,李金花,李巧汶

(广州医科大学附属第六医院，广东 清远 511500)

以动脉粥样硬化(atherosclemsis，AS) 为重要病理基础的心脑血管疾病在全球范围内有较高的发病率与死亡率，其导致的疾病是发达国家第一位的死亡原因，是威胁人类健康的主要疾病之一[1]。AS是以富含脂肪的斑块在大动脉壁聚积为特征的系统疾病，其发生的病理生理过程极其复杂，尚未完全清楚，目前主要观点包括炎性反应学说、血栓形成学说、脂质浸润学说等。目前大部分学者越来越重视炎性反应学说，认为炎性反应在AS的发生、发展、预后中均发挥重要作用。

蛋白酶激活受体-1(protease activated receptors, PAR-1)属于G蛋白偶联受体家族成员，与炎性反应密切关系[2-4]。研究发现，PAR-1的表达与粥样硬化斑块、易损斑块密切关系[5]。研究证实，PAR-1 拮抗剂作为新兴的抗血小板药物，在急性冠脉综合症的治疗中有明确的疗效[6-8]。但目前大部分关于 PAR-1 拮抗剂的研究集中在其抑制动脉内血栓形成的作用，对其对机体炎性反应的影响研究尚缺乏。本研究拟采用apoE-/-小鼠致AS模型，予PAR-1受体拮抗剂atopaxar及激活剂SFLLRN进行干预，观察小鼠炎性指标(IL-18、IL-10、CRP)的变化，探讨PAR-1受体对机体炎性的影响及意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取清洁级6-8周龄雄性apoE-/-小鼠64只 (购自常州卡文斯实验动物有限公司)，饲养于广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室，给予高脂饲料(含胆固醇1.2%，脂肪18%)喂养。喂养12周后，完全随机抽取4只apoE-/-小鼠，行血清血脂及主动脉病理学检查，观察apoE-/-AS模型建立是否成功。将余下成模后的60只apoE-/-小鼠随机分成6组(n=6)：空白对照组(B组)、阴性对照组(N组)、低剂量atopaxar组(AI组)、高剂量atopaxar组(AII组)、低剂量SFLLRN组(SI组)及高剂量SFLLRN组(SII组)。每组小鼠分笼饲养，每笼5只，自由摄取饮用水及高脂饲料。

1.2 给药方案

①空白对照组(B组)：高脂饮食；②阴性对照组(N组)：高脂饮食+淀粉片 20 mg/Kg qd；③低剂量atopaxar组(AI组)：高脂饮食+低剂量atopaxar 10 mg/Kg qd；④高剂量Atopaxar组(AII组)：高脂饮食+高剂量atopaxar 20 mg/Kg qd；⑤低剂量SFLLRN组(SI组)：高脂饮食+SFLLRN 10 mg/Kg qd；⑥高剂量SFLLRN组(SII组)：高脂饮食+SFLLRN 20 mg/Kg qd。每天上午给药1次，灌胃给药，持续8周。

1.3 标本的收集及检测

1.3.1收集 给药实验满8周后，处死动物并取材，分别取血及主动脉等组织。采用戊巴比妥气体麻醉小鼠，心脏穿刺取血，采血约0.8-1.0 mL，离心分离血清，置-20℃冰箱保存备用。

1.3.2采用ELISA法测定血清CRP、IL-18和IL-10水平(试剂盒购自上海BlueGene公司)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的变化

与B组相比，N组CRP、IL-18和IL-10均无明显差异(均为P>0.05)；AI组CRP、IL-18和IL-10均显著升高(P<0.05)；AII组CRP和IL-10均显著升高(P<0.05)，IL-18无明显差异(P>0.05)，相比于AI组，AII组CRP和IL-18显著降低(P<0.05))，IL-10显著升高(P<0.05)；SI组CRP、IL-18和IL-10均显著升高(P<0.05)；SII组CRP、IL-18和IL-10均显著升高(P<0.05)，相比于SI组，SII组CRP和IL-18显著升高(均为P<0.001)，IL-10显著降低(P<0.05)。与N组相比，AI组CRP和IL-10显著升高(P<0.05)，IL-18有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；AII组CRP和IL-18无明显差异(均为P>0.05)，IL-10显著升高(P<0.05)；SI组和SII组CRP、IL-18和IL-10均显著升高(P<0.05)，见表1、图1。

表1 各组小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的比较

图1 各组小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的比较

2.2 各组小鼠血清IL-18/IL-10比值比较

与B组相比，N组、AI组和AII组IL-18/IL-10无明显差异(均为P>0.05)，相比于AI组，AII组IL-18/IL-10有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；SI组、SII组IL-18/IL-10均显著升高(P<0.05)，相比于SI组，SII组IL-18/IL-10显著升高(P<0.05)。与N组相比，AI组IL-18/IL-10无明显差异(P>0.05)；AII组IL-18/IL-10显著降低(P<0.05)；SI组、SII组IL-18/IL-10均显著升高(P<0.05)，见表1、图1。

2.3 小鼠血清CRP与IL-18的相关性分析

小鼠血清CRP与IL-18呈正相关(r=0.941，P<0.05) ，见图2。

图2 小鼠血清CRP与IL-18相关性分析

3 讨论

1992年经基因敲除技术成功培育的apoE-/-小鼠，高脂饮食后可形成AS模型，该模型几乎包含了AS所有阶段的病变，是现今研究AS最好的模型之一[9]。本实验中，6-8周龄apoE-/-小鼠经12周高脂高胆固醇饲料饲养后，主动脉内膜可见大量的AS斑块及不同时期的AS病变，表明实验动物AS模型复制成功。

现已有研究证实，在AS发生发展的过程中，炎性反应贯穿其中，并扮演着重要的角色[10]。蛋白酶激活受体-1是参与凝血和炎性反应两大过程的关键一环，Schoergenhofer C等研究表明抑制PAR-1受体可显著降低凝血及炎性反应[11]。本实验中，AII组小鼠血清CRP、IL-18较AI组显著降低。IL-18已被证实作为一种促炎性因子参与AS病变全过程，血清IL-18升高可增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性[12]，经证实CRP与IL-18水平呈正相关，可见atopaxar可通过降低血清IL-18而具有一定的抵抗AS斑块不稳定性的作用，并能下调炎性反应发挥抗AS进展的作用。试验中AI组CRP、IL-18较对照组显著升高，考虑为atopaxar剂量偏低，对PAR-1受体拮抗程度不足，随着atopaxar剂量增大，CRP和IL-18呈下降趋势，达到降低机体炎性反应的效果。IL-10作为机体内重要的抗炎性因子，可通过抑制多种促炎性细胞因子的产生、下调细胞黏附分子表达和抑制免疫反应等，可发挥抗AS的作用[13-14]。本研究结果表明，AI、AII组IL-10较对照组显著升高，且AII较AI组IL-10明显升高。提示了atopaxar可通过对促炎性因子及抗炎性因子的调节，降低机体的炎性反应，可能发挥抑制AS病变进程的作用。

SI、SII组小鼠血清CRP、IL-18及IL-18/IL-10较对照组均显著升高，研究证实[13]，IL-18/IL-10比值能较客观地反应机体炎性/抗炎性系统的动态平衡状态，其比值增大表明炎性/抗炎性失衡以及炎性反应的增强，二者平衡失调可能是促使AS病变进展的重要原因，这表明SFLLRN可能通过升高血清炎性因子水平，加重机体促炎性因子/抗炎性因子平衡系统失调，发挥促进 AS病变进程的作用。且PAR-1受体激活剂SFLLRN的给药量越大，小鼠血清CRP、IL-18及IL-18/IL-10越高，IL-10越低，这表明PAR-1受体的激活程度增大，可加重炎性/抗炎性失衡，造成炎性反应的增强，从而促使AS病变的进展。另外，AII组IL-18/IL-10较AI组有下降趋势，但差异无统计学意义，这可能与样本量少、atopaxar组间增加剂量不够及atopaxar实验组设置少有关，这有待于后续加大样本量、增加组间递增剂量和增加atopaxar实验组以进一步论证。

综上所述，拮抗PAR-1受体可降低机体炎性反应，提示其可能抑制动脉粥样硬化的发生发展，而激活PAR-1受体可上调炎性反应，提示其可能抑制动脉粥样硬化的发生发展。 本研究表明，PAR-1受体在炎性反应中发挥重要作用，可能是抗动脉粥样硬化中的重要药物靶点。