某三甲医院主要革兰阳性菌临床分布及耐药性分析

2020-06-15郑远明毕晓英周杰

国外医药（抗生素分册） 2020年1期

郑远明，毕晓英，周杰

(大连市友谊医院，大连 116001)

革兰阳性菌，是将微生物进行革兰染色，从而进行颜色区分，颜色呈蓝色或紫色的一个种类的细菌。临床上常见的革兰阳性菌主要为金黄色葡萄球菌，屎肠球菌等[1]。革兰阳性菌虽不像革兰阴性细菌那样在临床上常见，但也一直处于居高不下的状态，60年代已经证实菌株耐药率高与抗生素消耗有关[2]。由于临床上抗菌药物的使用不当，使革兰阳性菌一直处于高度耐药的情况，尤其是金黄色葡萄球菌。本研究对2018年友谊医院的革兰阳性菌及其耐药率进行统计分析，希望对临床针对革兰阳性菌的用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

分别收集2018年1月—2018年12月从大连市友谊医院各个临床科室送检的感染性标本，主要包括：尿液、痰液、全血、浓汁、分泌物、引流液、腹水等分离出的革兰阳性菌，共324株。药敏质控对照菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213，肠球菌ATCC29212，由卫生部临床检验中心提供。

1.2 仪器与试剂

电热恒温培养箱为上海新苗医疗器械制造有限公司，全自动微生物分析系统VITEK-2和BACT ALERT 3D全自动血培养仪及其培养瓶和菌株鉴定及MIC法药敏试剂为法国BIOMERIEUX公司产品。哥伦比亚血琼脂、伊红美蓝琼脂、MH药敏琼脂培养平板及替考拉宁药敏纸片来源Oxoid公司。

1.3 细菌鉴定与体外药敏试验

按《全国临床检验操作规程》(第4版)相关要求进行分离培养，通过辨别菌落形态、气味、革兰染色和全自动微生物分析系统VITEK-2等多种方法对菌种进行鉴定。用K-B纸片扩散法和MIC法检测其耐药性，根据2018年临床和实验室标准化协会(CLSI)指导原则判读细菌耐药性。

1.4 数据分析

采用处理WHONET 5.6统计分析比较菌株对不同抗菌药物的耐药性。SPSS19.0软件，进行卡方检验，计算卡方值(x2)，以P＜0.005具有统计意义。

2 结果

2.1 革兰阳性细菌科室分布情况

重症医学科内科(16.05%)和泌尿外科(16.36%)居首位，老年病科(9.57%)、NICU病房(8.33%)、普外科(8.33%)，骨外科(7.72%)和肝胆外科(5.25%)相对较多。其余科室的占比均≤5%。金黄色葡萄球菌主要分布在重症医学科，老年病科和骨外科。屎肠球菌也主要来源于重症医学科。而表皮葡萄球菌主要来源于普外科，粪肠球菌主要来源于泌尿外科，详情参考表1。

2.2 革兰阳性菌的标本来源

在所有标本中，以尿液分离出来的菌株数量最多(32.1%)，其次为痰液(19.14%)，浓汁(14.5%)，分泌物(11.7%)。其余的标本来源占比均不超过百分之十。金黄色葡萄球菌主要来源于痰液，其次来源于浓汁和分泌物。屎肠球菌和粪肠球菌主要来源于尿液，其中屎肠球菌从尿液分离出来的更多，约为粪肠球菌的两倍。而表皮葡萄球菌主要来源于全血标本，详情参考表2。

2.3 葡萄球菌耐药性分析

所有葡萄球菌对万古霉素和达福普汀的耐药率均为0，而对青霉素G的耐药率很高，尤其是金黄色葡萄球菌(92.5%)。其中金黄色葡萄球菌不仅对万古霉素和达福普汀无耐药现象，还对替考拉宁也无耐药现象出现，其次对红霉素的耐药率也很高(64.9%)。而表皮葡萄球菌除了对青霉素G有很高的耐药率(90.2%)，对苯唑西林(69%)、左旋氧氟沙星(60.7%)和红霉素(73.8%)的耐药率也超过了50%，并且表皮葡萄球菌对替加环素也100%敏感，其他抗生素耐药率详情参考表3。

表1 革兰阳性菌的科室分布

2.4 肠球菌的耐药性分析

所有肠球菌对高浓度庆大霉素和高浓度链霉素还有替加环素均100%敏感，并且不管是粪肠球菌还是屎肠球菌对红霉素和四环素的耐药率均＞50%。其中屎肠球菌的耐药情况更严重，除了红霉素和四环素，对青霉素G(95.2%)、氨苄西林(95.2%)、环丙沙星(92.9%)、左旋氧氟沙星(92.9%)、莫西沙星(92.9%)和呋喃妥因(80%)等抗生素的耐药率较高。而相比粪肠球菌的耐药情况稍微好一些，对氨苄西林、利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁和替加环素都是100%的敏感。对其他抗生素的耐药率也不超过40%，详情参考表4。

表2 革兰阳性菌的标本来源分布

2.5 葡萄球菌的相关性分析

从数据分析可得，苯唑西林、环丙沙星和左旋氧氟沙星，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌对上述药物的耐药性的形成有一定的相关性。而这两种葡萄球菌针对其他药物耐药性的形成根据友谊医院提供的数据来看，并不具有相关性，详情参考表5。

2.6 肠球菌的相关性分析

可以得出粪肠球菌与屎肠球菌在青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星、呋喃妥因等药物的耐药相关性有统计学意义，即根据现有样本信息，可以认为该医院粪肠球菌与屎肠球菌对这几种药耐药性的形成有一定相关性。详情参考表6。

3 讨论

目前为止能查到的最早关于革兰阳性菌耐药情况的文献是在1995年，当时文献记载并未出现耐药菌株[1]。但是据记载在20世纪60年代，就出现了“超级细菌”即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[2]。之间间隔这么多年，革兰阳性菌的耐药情况并未引起重视，且也无多严重的变化。直到最近可查的2002年，才有记载出现革兰阳性菌的耐药菌株，且此时耐药情况已是十分严重，文献显示此时的革兰阳性菌株对青霉素的耐药情况最为严重，其余抗生素还未出现耐药情况，可能与当时抗生素的种类还未研发出像今天这样繁多有关，抗生素较单一[3]。

表3 葡萄球菌的耐药率(%)

本次研究中，革兰阳性菌检出率最高的科室主要在重症医学科内科和泌尿外科，根据病情有关，也跟病人此时的体质和免疫力及耐药机制都有一定的相关性，居住在这种科室的患者身体多器官多系统受损，免疫功能下降，人体身上的正常菌群以及自身的微生物作为条件致病菌导致感染的发生。其次是普外科、老年病科和NICU科查出的革兰阳性菌也略高，想必和病人的年龄，病情的严重程度以及老年患者免疫力低下有一定的相关性，后两个科室居住的患者通常都免疫力低下，器官衰老退化，并且大多都有慢性疾病，且可能并不是一种疾病，这种几种病情相交导致治疗复杂化，机体多器官多受损严重。据了解老年人中41～60岁病人感染最高为28.8%，且其病种涉及较广；＞61岁的病人感染率亦较高[4]。在所有标本来源中，从尿液分离出来的革兰阳性菌是最高的，其次为痰液、浓汁和分泌物的革兰阳性菌的检出率也略高，与标本来源的部位有关，还有其存在部位为细菌生产繁殖提供了相应的生存环境，故检出率较高。而在所有的标本中，尿液的粪肠球菌和屎肠球菌的检出率是最高的，符合细菌的生长环境[5]。金黄色葡萄球菌在痰液中检出率最高，除了在临床标本收集中，痰液的收集储存量是最多的以外，也可以看出金黄色葡萄球菌主要生长繁殖在呼吸道等器官中[6]。而表皮葡萄球菌是人体皮肤正常菌群，其检出率在血培养和浓汁中最高，估计标本污染的可能性大，提示需要加强临床血培养和浓汁的正确采集，同时需要结合临床表现，也不排除其为条件致病菌。虽然本院每年革兰阴性菌数是革兰阳性菌4～5倍[7]，本次研究中的阳性菌还是很有积极意义的。

在革兰阳性菌对所有药物耐药率的统计中，对青霉素G和红霉素的耐药率是最高的。青霉素G主要是通过对细菌细胞壁进行代谢干扰，引起细菌的形态变化而发挥作用的，之所以会产生耐药主要是细菌产生了灭活酶—青霉素酶，或与青霉素结合蛋白的改变和作用靶位的改变。而红霉素属于大环内酯类抗生素，通过抑制细菌蛋白质的合成而发挥作用，主要也是通过改变作用靶位而产生耐药性[8]。

表4 肠球菌的耐药率(%)

表5 葡萄球菌的相关性分析

表6 肠球菌的相关性分析

革兰阳性细菌中对抗生素耐药性最严重的细菌是金黄色葡萄球菌。无论国内外，金黄色葡萄球菌对多种抗生素的耐药率均高于其他革兰阳性菌对所检测抗生素的耐药率[9]。对所测的十六种抗生素中，除了万古霉素、替考拉宁、达福普汀和替加环素这四种抗生素有100%的敏感率外，几乎对剩下的抗生素都有一定的耐药性，且对青霉素G(92.5%)和红霉素(64.9%)的耐药率已经超过了50%，对剩下的抗生素耐药率即使未超过50%，但据数据显示情况也不容乐观，需谨慎对待。结果也显示金黄色葡萄球菌对万古霉素、替考拉宁、达福普汀和替加环素敏感率很高，几乎达到100%的敏感，其中万古霉素和替考拉宁属于多肽类抗生素，可能与多肽类抗生素作用机制有关，且临床上，只有在严重感染时才会使用这两种抗生素，也可能与使用的频率有关。

表皮葡萄球菌，除了对青霉素G(90.2%)和红霉素(73.8%)的耐药率很高外，对左旋氧氟沙星(60.7%)环丙沙星(47.5%)的耐药率也较高，应值得注意。此外，表皮葡萄球菌对利奈唑胺的敏感率也很高，可能是因为利奈唑胺严格意义上来说属于噁唑烷酮类抗生素，是人工合成的药物，作用方式和作用部位独特，所以不易诱导细菌耐药性的产生，在临床用药上有一定的作用[10]。

肠球菌也是医院感染细菌中主要的一类，最常见的为屎肠球菌和粪肠球菌[11]。而其中屎肠球菌的耐药性更严重一些，对多种抗生素耐药且耐药率比粪肠球菌的耐药率要高一些。而粪肠球菌对红霉素(71.7%)和四环素(84.4%)的耐药率高一些除外，其余所测的抗生素的耐药率都保持在乐观的情况。结果显示，对屎肠球菌敏感率较高的抗生素药物有高浓度庆大霉素，高浓度链霉素和替加环素等，其余抗生素的耐药率都不容乐观，据研究显示，屎肠球菌和粪肠球菌耐药率区别很大的原因是，屎肠球菌可产生含有毒力因子和耐药相关蛋白的膜囊泡[12]，故有这种膜囊泡的防护和毒力因子的作用，对多种抗生素的耐药率要高一些。故以上两种肠球菌应长期监测，以便于临床用药提供参考依据。

相关性结果显示，苯唑西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星对于葡萄球菌的耐药性的形成存在正相关性，苯唑西林为窄谱半合成青霉素，对革兰阳性球菌有抗菌活性，不易被β-内酰胺酶破坏，对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等有较强的抗菌活性，尤其是产酶的金黄色葡萄球菌[13]，所以在临床上使用频率很高，且应用广泛，所以容易由于药物滥用导致耐药性提高。除苯唑西林以外，环丙沙星和左旋氧氟沙星都属于氟喹诺酮类化合物，都属于广谱抗生素，而且对革兰阴性菌的药效明显优于对革兰阳性菌的药效，通常作为广谱抗生素，会广泛应用且用药时间长，也有可能是形成葡萄球菌耐药性的原因。青霉素G、氨苄西林都属于青霉素类抗生素，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和肠球菌都具有较强的抗菌作用，但是大肠埃希菌等因部分菌株产生β-内酰胺酶，故存在不同程度的耐药菌[14]。环丙沙星、左旋氧氟沙星和莫西沙星都属于氟喹诺酮类化合物，早年第一代氟喹诺酮类的抗生素仅用于尿路感染，而这三种已经是第三代和第四代抗生素，虽然应用范围广泛，但主要作用靶位都是在细菌的DNA旋转酶，仅少数学者认为有质粒介导所致的耐药性，且本类药品之间存在交叉耐药性[15]，故在肠球菌耐药性相关性的分析中，有三种喹诺酮类的抗生素都呈正相关。呋喃妥因广泛用于治疗泌尿系感染疾病，在临床治疗中使用频繁且沿用至今，故与肠球菌的耐药性呈正相关。

细菌耐药检测是为了了解细菌对临床常用药物的耐药变迁[16]，更是为了控制抗生素药物在临床上的使用频度，以免出现更多耐药率更高的“超级细菌”，有研究报道[17]，药物的耐药性与该药的使用量成正相关，减少使用后敏感性会逐渐回升，故细菌耐药检测有一定的必要性。细菌耐药在不同时间不同地区有较大的区别，故应进行长期的耐药监测，更及时更准确地为临床用药提供帮助。