苯磺贝他斯汀片中基因毒性杂质苯磺酸乙酯与苯磺酸异丙酯的含量测定

2020-06-15舒理建楼赛丽吴晨皓卢鑫鑫邵旭民浙江普洛康裕制药有限公司浙江东阳322118

化工管理 2020年15期

舒理建楼赛丽吴晨皓卢鑫鑫邵旭民（浙江普洛康裕制药有限公司，浙江东阳322118）

苯磺贝他斯汀是非镇静类高选择性组胺受体拮抗剂，对肥大细胞具有稳定作用，能够阻止嗜酸性粒细胞迁移至炎症组织，并可抑制白细胞介素-5、白三烯B4（LTB4）和血小板活化因子（PAF），减轻过敏炎症，是一种高效的抗过敏药物，不良反应较轻微。[1-3]苯磺贝他斯汀的合成过程中采用了乙醇和异丙醇，易与苯磺酸反应生成苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯。两者为基因毒性杂质，人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）于2014年发布M7（基因毒性杂质指南）。指南中对基因毒性杂质限度计算做了指导，计算得出苯磺贝他斯汀中含苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯的限度均为75 ppm。欧洲药典采用液相质谱联用法进行苯磺酸乙酯含量测定，但仪器昂贵，在药企不能广泛适用。所以，建立了该方法并做了方法学验证。

1 仪器与材料

1260 高效液相色谱仪（紫外检测器，美国Agilent 公司）；MILLIPOR超纯水机（德国默克公司）；DK-360HTD超声清洗仪（深圳市得康洗净电器有限公司）；XS105十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。乙腈（色谱纯，德国merck公司）；磷酸（色谱纯，德国CNW公司）。苯磺贝他斯汀片（日本田边三菱制药株式会社）；苯磺酸乙酯对照品（TCI 公司）；苯磺酸异丙酯对照品（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ACE 3 C8色谱柱(150*4.6 mm，3 um)；流动相为乙腈—0.1%磷酸水溶液=1：3，等度洗脱；检测波长为220 nm；流速为0.9 ml×min-1；柱温30 ℃；进样量为20 ul。

2.2 溶液的配制

空白溶剂（稀释剂）：取乙腈和水，以95：5比例混合，即得。

苯磺酸乙酯对照品储备液的配制：精密称取苯磺酸乙酯约144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀；另精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得苯磺酸乙酯对照品储备液。

苯磺酸异丙酯对照品储备液的制备：精密称取苯磺酸异丙酯144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀；另精密量取此溶液1 ml 置于100 ml 量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得苯磺酸异丙酯对照品储备液。

对照溶液配制：分别精密量取苯磺酸乙酯对照品储备液1ml和苯磺酸异丙酯对照品储备液1 ml，置同一10 ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适用性溶液：即对照溶液。

供试品溶液配制：苯磺贝他斯汀片研磨成均匀粉末，取约0.32 g，精密称定，置10 ml 量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验

在上述色谱条件下，取苯磺酸乙酯与苯磺酸异丙酯对照溶液重复进样6次，峰面积的RSD 分别为1.20%和1.45%，均小于2.0%。

2.4 专属性试验

取苯磺贝他斯汀片粉末约0.32 g，精密称定，置10 ml 量瓶中，用少许稀释剂溶解，加入1 ml 苯磺酸乙酯储备液和1 ml 苯磺酸异丙酯储备液，用稀释剂稀释之刻度，摇匀，进样。结果表明其他未知杂质与苯磺酸乙酯、苯磺酸异丙酯分离度良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.5 检测限与定量限

分别精密量取苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯对照品储备液适量，采用逐步稀释法进行检测限与定量限测定。在220 nm的检测波长下，信噪比＞3时的浓度为检测限，信噪比＞10时的浓度为定量限。苯磺酸乙酯的检测限和定量限分别为0.000032 mg×ml-1（信噪比为3.6）和0.00032 mg×ml-1（信噪比为22.2）。苯磺酸异丙酯的检测限和定量限分别为0.000064 mg×ml-1（信噪比为6.5）和0.00032 mg×ml-1（信噪比为14.4）。在定量限浓度下，样品重复进样6 次，苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯的峰面积RSD分别为2.55%和2.42%，均满足测定要求。

2.6 线性范围

取苯磺酸乙酯与苯磺酸异丙酯对照品储备液，分别精密量取适量，配制成0.00032，0.00064，0.00096，0.00192，0.0024，0.00288 mg×ml-1的系列标准溶液。在220 nm 的检测波长下进样分析，以浓度（C，mg×ml-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行回归线性分析，苯磺酸乙酯的线性方程为A=24327C+0.4199，相关系数r 为0.9989，苯磺酸异丙酯的线性方程为A=19830C+1.7887，相关系数r，0.9986，说明苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯的峰面积与其浓度在0.00032 mg×ml-1-0.00288 mg×ml-1内线性关系良好。