基于GEO数据库筛选垂体泌乳素瘤发生的关键差异基因

郑诗豪 张 扬 杨 波 陈忠仪 黄绍崧 黄绳跃

福建省立医院，福建 福州 350001

垂体泌乳素瘤是最常见的垂体功能性腺瘤，占垂体腺瘤总数的32%～66%[1]。据国外文献报道，垂体泌乳素瘤的发病率约为27人/(百万人·年)[2]。虽然发病率较低，但其是患者性欲减退、不孕，女性月经不规律、溢乳，男性勃起障碍的最常见病理原因[3]。临床上治疗手段包括多巴胺激动剂卡麦角林和溴隐亭为主的药物治疗、手术切除以及放射治疗，从而达到缩小肿瘤、降低血高泌乳素水平、保存垂体前叶功能的治疗目标[4-5]。虽垂体泌乳素瘤被认定为良性肿瘤，但由于部分患者耐药、特殊的激素分泌紊乱、术后再次复发概率大等问题，给临床诊治带来一系列挑战[3，6]。

随着分子生物学理论和技术的发展，靶向药物治疗已经成为当今肿瘤研究的热点[7]。在神经系统肿瘤中，随着部分脑肿瘤的分子生物学发生机制被逐步阐明，2016版的WHO分类标准中首次引入了分子学特征对中枢神经系统肿瘤进行分类，标志着神经肿瘤的诊断迈入了精准医学的大门，对患者的治疗和预后有重大意义[8]。而在泌乳素瘤中，ZHANG等[9]发现高表达的溶质蛋白运载家族2、促葡萄糖转运载体11、嗜铬粒蛋白B可能在泌乳素瘤的发展中起重要作用。FARAONI等[10]发现转化生长因子β1系统可能参与泌乳素瘤进展。ZHONG等[11]发现京尼平(genipin)在泌乳素瘤细胞中可促进上调EGR1和P21的表达，并抑制泌乳素瘤细胞的增殖和迁移，是一种可能治疗泌乳素瘤的潜在药物。虽然越来越多的研究已集中在泌乳素瘤的发生、发展的分子层面，但目前人们对其具体机制的了解仍十分有限。因此，阐明泌乳素瘤发病机制，从而发现疗效更好、不良反应更少的新治疗策略显得尤为重要[6]。

本研究通过对选出的GEO芯片中泌乳素瘤和正常垂体样本的基因表达谱进行生物信息学分析，为进一步探究泌乳素瘤发生的潜在机制提供分子基础，为泌乳素瘤的治疗提供可能的新靶点。

1 资料与方法

1．1基因表达谱数据的选择与获取从GEO数据库中选择编号为GSE119063的人泌乳素瘤组织表达谱芯片，该芯片基于GPL13607平台Agilent-028004 SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray检测。由5例垂体泌乳素瘤组织样本和4例正常脑垂体组织样本组成。提取该芯片中泌乳素瘤与正常对照垂体组织的基因表达数据，用于后续进一步分析。

1．2差异基因的提取与分析使用R软件(版本号为3．6．2)，利用limma包对各个基因表达谱间数据进行归一化处理，消除非实验因素带来的误差。设置差异基因筛选条件：差异倍数>4倍且P<0.01(logFold Change>2 & adjustP<0.01)，得出符合条件的泌乳素瘤与正常脑垂体芯片中的差异基因。应用R软件相关函数可视化筛选出的差异基因，绘制出火山图及热图。

1．3差异基因的功能富集和注释分析对差异基因进行GO功能注释和KEGG功能富集分析。使用R语言软件函数，设置P<0.05为条件，得出差异基因功能注释的GO结果，该结果由生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3个方面组成。

将以上筛选出的关键差异基因导入DAVID 6.8在线分析网站进行KEGG信号通路分析，将下载分析结果导出后，应用R软件的ggplot2包按照条件P<0.05条件筛选出排名前10的通路。

1．4构建差异基因间蛋白质-蛋白质相互作用关系图利用STRING网站分析差异基因间蛋白质的互相作用关系，在线生成蛋白质相互作用网络图(protein proteininteraction network，PPI network)。统计PPI网络中各蛋白之间的关系对数，按照关系对数数目排序，取前20个的蛋白，筛选出与垂体泌乳素瘤相关的关键差异基因。

2 结果

2．1芯片中垂体泌乳素瘤与正常垂体组织间显著差异基因的筛选应用R软件中limma和impute包，在筛选条件：logFold Change>2 & adjustP<0.01，得出差异基因279个，与正常垂体组织相比，泌乳素瘤中表达上调的基因数目23个，表达下调的基因数256个(表1)。将筛选出的差异基因绘制火山图，并选取差异最显著的前150个基因绘制热图(图1)。

2．2差异基因的功能富集和注释分析使用R语言进行GO功能注释分析，分别取生物学过程、细胞组分以及分子功能前10个条目以条形图的形式展现(图2A)。在BP上与视觉系统发展、生殖系统发展、感官系统发展、胶质细胞生成、上皮细胞增殖、胚胎器官发育、呼吸系统发展相关；在CC上与细胞外基质胶原、内质网腔、肌动蛋白基细胞投射簇、微纤维和刷状缘有关；在MF上与受体配体活动、细胞外基质结构组成、激素的活动、生长因子活性、同向转运运动、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、电解质同向转运活动、胰岛素样生长因子、生长因子结合、跨膜受体蛋白激酶活性等相关。

利用DAVID 6.8在线分析工具对上述关键差异基因进行KEGG信号通路分析，得到11个KEGG信号条目。运用R语言取P<0.05且最显著的前10个条目以气泡图显示(图2B)，包括TGF-β signaling通路、干细胞多能性调控信号通路、视黄醇的新陈代谢通路、刺激神经组织的中交互刺激通路、细胞色素P450对外源性药物代谢通路等

图1 芯片数据的处理结果 A：归一化前不同基因表达谱芯片的中位数值不一致，存在较大误差；B：归一化后，各表达谱芯片中的中位数在同一水平上，消除了其他干扰实验的误差；C：火山图展示了芯片中的差异基因，对比正常垂体组织，其中红色的点代表泌乳素瘤高表达的基因，绿色的点代表泌乳素瘤中低表达的基因；D：聚类热图展示了差异最显著的前150个基因，红色代表高表达信号，绿色代表低表达信号Figure 1 Processing results of chip data.A：Before normalization，the median values of microarrays with different gene expression profiles were inconsistent，resulting in large errors；B：After normalization，the median in each expression profile chip is at the same level，eliminating the error of other interference experiments；C：The volcano diagram shows the differential genes in the microarray，comparing the normal pituitary tissues，where the red dots represent the genes with high expression in prolactioma and the green dots represent the genes with low expression in prolactioma；D：The cluster heat map shows the first 150 genes with the most significant differences，with red representing high expression signal and green representing low expression signal

2．3蛋白相互作用网络分析利用STRING网站构建PPI网络，将差异基因导入在线分析网站，设置条件interaction socre<0.4，并剔除孤立的节点，得出蛋白质相互作用网络图，该图由388个节点和205个蛋白相互作用对构成。根据计算每个蛋白的作用对数，得出前20个关键基因，如SOX2、PAX6、SOX9、POMC、WNT5A、GNC8、CCK、IGFBP3等(图3)。

图2 差异基因的功能分析 A：差异基因GO富集分析结果；B：差异基因KEGG通路富集分析结果Figure 2 Functional analysis of differential genes.A：GO enrichment analysis results of differential genes；B：Enrichment analysis results of differential gene KEGG pathway

图3 差异基因蛋白与蛋白互相作用网络 A：利用STRING网站构建差异的蛋白互相作用网络图；B：根据蛋白之间临近相互作用对计数，选取前20个关键差异基因Figure 3 Protein-protein interaction network of differential genes A：Using the STRING website to construct the network diagram of different protein interactions；B：The first 20 key differentially expressed genes were selected based on the pairs of adjacent interactions between proteins

表1 利用R语言中limma包筛选出泌乳素瘤组织与正常垂体组织的差异基因Table 1 Differential genes between prolactioma tissues and normal pituitary tissues were screened by using the limma package in R language

3 讨论

垂体泌乳素瘤是一种分化良好的肿瘤，但由于其具有分泌激素的功能，可导致患者产生明显的内分泌综合征，此外，肿瘤不断生长压迫正常脑组织也会引起相应的神经功能缺失[12]。尽管口服多巴胺激动剂和选择性切除泌乳素瘤是目前主要的临床治疗方法[13]，但其相关的不良反应仍不容忽视[14]。部分患者的药物耐药性及手术切除本身的风险、术后肿瘤复查等问题一直是摆在医生面前的重大难题[15-16]。近年来，对泌乳素瘤的研究逐渐增多，但对于其发生的分子机制仍知之甚少。分子层面的研究有助于了解疾病的发病机制，并可能通过识别新的生物标志物改变疾病的整个治疗方案，并获得更好的预后[17-18]。本研究为阐明泌乳素瘤的发生发展机制提供了可靠的研究数据和可能的治疗新靶点。

本研究通过分析GSE1190635中5例垂体泌乳素瘤组织样本和4例正常脑垂体组织样本基因表达谱芯片，筛选出279个差异表达基因。差异基因GO功能注释分析表明，在细胞成分上，差异基因主要集中在胶原组成的细胞外基质、内质网内腔、肌动蛋白细胞簇；在生物学过程中主要体现在呼吸、生殖、感官及视觉系统的发展、胶质细胞、上皮细胞的生成；分子功能表现在受体配体活动、细胞外基质结构组成、生长因子的活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、胰岛素样生长因子I等。差异表达基因主要涉及生长、代谢、生殖等调节功能，而这些功能是正常脑垂体的主要生理功能，因此，在泌乳素瘤中，这些功能可能受到不同程度的影响，导致异常症状的出现；此外，泌乳素瘤本身的肿瘤属性也可能引起生长、代谢方面功能的变化[19-20]。可以通过GO分析结果解读泌乳素瘤相关的生物学过程，如泌乳素瘤患者普遍存在葡萄糖、胆固醇和甘油三酯间的代谢障碍[21]，这与胰岛素功能的异常密切相关，其中胰岛素负责抑制胰岛素生长因子I[22]，与GO分析结果不谋而合，可以推断胰岛素生长因子I在泌乳素代谢变化中的联系和重要性。

KEEG通路主要富集在TGF-β信号通路、干细胞多能性调控信号通路、视黄醇新陈代谢通路、细胞色素P450药物代谢通路、细胞因子受体间相互作用通路等。ELENKOVA 等[23]发现，TGF-β是判定泌乳素瘤侵袭性的一个可靠血清标志物；LI等[24]提出TGF-β/Smad3通路在泌乳素瘤对多巴胺能药物的耐药中起重要作用；HU等[25]进一步证实TGF-β1/Smad3通路通过导致肿瘤细胞外纤维化从而引起泌乳素瘤耐药。肿瘤干细胞与恶性肿瘤的发生、发展、复发等生物学过程密切相关，且与放化疗的耐药性相关，在良性肿瘤分离出肿瘤干细胞并不常见。GAO等[26]在人和大鼠泌乳素瘤中均发现存在表达干细胞标志物的细胞，而且在表达干细胞标志物CD133的肿瘤细胞中发现了对多巴胺能药物耐药的情况。视黄醇代谢的视黄酸在垂体组织的正常发育和功能维持中起重要作用，同时也是垂体前叶细胞的调节因子。FUJIWARA等[27]发现，在大鼠模型中，局部视黄酸的减少与泌乳素瘤细胞的增殖有关。细胞色素P450酶已被证实在泌乳素瘤组织中表达，且表达程度与肿瘤的侵袭性相关[21，28]。

根据蛋白互相作用关系筛选出前20个关键差异基因，其中SOX2作为干细胞标志物，已被GAO等[26]在人和大鼠的泌乳素瘤组织发现，而有研究报道垂体腺瘤中的POMC表达明显高于垂体[29]。余下基因目前尚未见在泌乳素瘤中的报道。这些关键基因有可能在垂体泌乳素瘤的发生、发展过程中发挥重要调节作用，有望成为泌乳素瘤治疗的新靶点。

本研究利用GEO表达谱数据筛选出了泌乳素瘤与正常垂体组织中差异基因，通过富集分析探讨了其可能的分子机制，并通过蛋白互相作用网络分析得出关键作用差异基因。目前，世界上对于泌乳素瘤的分子机制研究十分匮乏[30]，本研究得出的关键差异基因鲜有报道。相信本研究结果将为后续研究者对泌乳素瘤的生物学过程的理解提供帮助，为寻找新的分子标志物提供参考研究对象，同时也为泌乳素瘤提供新的潜在治疗靶点。