NKG2D配体在人脑胶质瘤细胞的表达及其在体外条件下对NK细胞杀伤活性的影响

张 鹏 韩伟杰 孙红卫 黄德海

1)郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052 2)河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191

近年来，免疫治疗在肿瘤治疗领域取得了革命性进展[1]。肿瘤的免疫治疗于 2013 年被 Science 评为年度十大科技突破之首，为肿瘤治疗带来新的希望[2-5]。NK细胞是机体固有性免疫的主要组成细胞之一，在抗肿瘤、抗病毒、抗胞内寄生菌以及移植排斥反应中发挥着重要作用[6-7]。表达于NK细胞表面的NKG2D(natural killer group 2D) 是NK细胞识别、杀伤肿瘤细胞的最主要的杀伤活化受体[8-10]，其配体主要为肿瘤细胞表面的属于非HLA-I类分子的UL16结合蛋白(UL16 binding protein，ULBP)家族(ULBP1、ULBP2、 ULBP3)和MHC-I类链相关分子(MHC class I chain-related molecule，MIC)(MICA、MICB)，这些配体分子主要存在于上皮细胞肿瘤以及白血病细胞系中[11]。人脑胶质瘤(human glioma cell，HGC)属于神经上皮肿瘤，本文通过流式细胞仪技术探讨NKG2D配体在HGC的表达情况，并进一步分析其在体外条件下NK细胞杀伤HGC效应中的作用。

1 材料与方法

1．1 HGC的分离、培养无菌状态下取新鲜肿瘤组织块约10 g，浸泡于DMEM/F12培养基，PBS液冲洗，剪切组织块(0.5～1 mm3)，加入6倍体积的0.25%胰蛋白酶消化，并每隔3 min反复吹打、摇荡肿瘤组织块，消化至肿瘤组织块分散为单个细胞或细胞团，10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，组织悬液用200目的不锈钢丝网过滤；离心5 min，10%胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮离心沉淀；台盼兰染色法计算活细胞数及密度；3×105个/mL细胞的密度接种于培养瓶中；培养箱中培养；每2～3 d换液1次。观察细胞生长情况和形态学改变。

1．2 NK细胞NK细胞的分离、纯化及培养密度梯度离心法分离1例健康志愿者外周血单个核细胞，MACS法分选NK细胞；流式细胞仪检测NK细胞纯度。NK细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL，IL-2 1 000 U/mL)，以2×105/cm2细胞密度接种于培养瓶中，置37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中，以培养24 h后的NK细胞作为效应细胞。

1．3 HGC表面的NKG2D配体的表达取处于对数生长期的HGC，以3 000 rpm离心10 min，PBS洗涤3次，细胞计数并分管，按每106个HGC细胞1 μg的量分别加入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3分子抗体，对照管加入鼠抗人IgG1；4 ℃标记30 min；流式细胞仪分析每104个细胞中阳性细胞数，计算表达率。重复实验3次，计算平均值。

1．4 NK细胞杀伤活性测定不同效靶比时NK细胞杀伤活性(MTT法)；抗体封闭试验：取效靶比为50：1，在靶细胞孔分别加入anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP1、anti-ULBP2及anti-ULBP3单抗，室温培养30 min后加入NK细胞，测NK细胞对HGC的杀伤活性。NK细胞杀伤活性(%)=(实验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD-靶细胞自然释放组OD)×100%。

1．5统计学处理应用SPSS 18.0软件进行数据处理，NK细胞对HGC不同杀伤活性的比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2．1 NK细胞的纯度分选后的NK细胞的纯度达91.67%。

2．2 NKC2D配体在HGC的表达HGC表面表达NKG2D的配体MICA、ULBP2、ULBP3，不表达NKG2D的配体MICB、ULBP1(图1)。MICA、ULBP2和ULBP3分子在HGC表面的表达率分别为63.52±6.67%、62.01±5.65%和51.36±2.38%，在HGC表面不表达MICB和ULBP1。

图1 HGCs表面NKG2D的配体表达Figrue 1 NKG2D ligand expression of on HGCs surface

2．3NK细胞杀伤活性的测定及NKG2D配体对NK细胞杀伤活性的影响 MTT法结果显示：当效靶比分别为10∶1、20∶1、50∶1及100∶1 时，NK细胞对HGC的杀伤活性分别为(23.58±1.69)%、(37.17±3.45)%、(49.69±4.31)%及(54.07±6.12)%。在各效靶比时(除效靶比50∶1组与效靶比100：1组间外)，NK细胞对HGC的杀伤活性在各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。

效靶比为50∶1时，用anti-MICA、anti-ULBP2及anti-ULBP3分别对HGC表面相应的MICA、ULBP2及ULBP3分子进行封闭，NK细胞对HGC的杀伤活性分别为(40.86士2.14)%、(39.15士1.43)%和(37.88士2.35)%，与封闭前(49.63±4.28)%相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

NK细胞的细胞杀伤效应和其表面杀伤受体密切相关。依功能的不同，杀伤受体分为杀伤抑制受体和杀伤活化受体，前者诱导抑制NK细胞的杀伤活性，后者诱导NK细胞杀伤活性。NKG2D是NK细胞表面的重要杀伤活化受体之一，在树突状细胞、T细胞、巨噬细胞表面也有表达[12]。人NKG2D配体分为两大类：MIC和ULBP家族，前者包括MICA和MICB，后者包括ULBP1、ULBP2和ULBP3[13-14]。

MIC基因位于经典的HLA-Ⅲ类基因区，是Ⅰ型跨膜蛋白。在正常细胞人体细胞中，MIC仅发现于肠黏膜上皮细胞表面，而几乎所有的人上皮源性肿瘤均发现MIC分子的表达[15-16]。MIC是一种易于激活表达的基因，在一些肿瘤细胞、病原体感染细胞及应激细胞均可增强表达[17-19]。

ULBP家族编码基因位于人染色体的6q25区的MHC之外的区域，其基因与MIC基因无关。ULBP1、ULBP2和ULBP3结构都与HLA-I类分子的α1、α2结构域有同源性，表达较广泛，可见于多种细胞、组织和肿瘤。所有的ULBP家族成员都缺乏a3功能域，不能与抗原肽结合。

NKG2D配体的表达差异性很大，不同的肿瘤细胞表达可能不同；既使同一肿瘤不同的细胞系，NKG2D配体的表达也可不同。FUCHS等[20]研究发现，ULBP在不同的黑色素瘤细胞系表达有较大的差异。NKG2D与其配体识别所诱导的杀伤活化效应可以消除杀伤抑制受体诱发的NK细胞抑制性效应[17]。因此，NKG2D的活化程度一定程度上决定着NK细胞杀伤肿瘤细胞效应的水平。而这种活化程度是由效应细胞(肿瘤细胞)表面的NKG2D配体决定的，因此，增加效应细胞表面配体的表达是增强抗肿瘤效果的重要途径之一。有研究用羟基脲诱导慢性髓性白血病细胞系OUN-1细胞表面的NKG2D配体的表达增加，从而增强NKG2D和其配体的相互作用介导的NK细胞对白血病细胞的杀伤效应[21]。

本研究表明，HGC表达NKG2D配体MICA、ULBP2及ULBP3分子，不表达MICB和ULBP1分子。因此任意个体的NK细胞都存在杀伤HGC的分子基础。不同肿瘤细胞表达的配体不同，既使在不同的肿瘤中表达相同配体，由于配体数量的差异，NK细胞的效应也不同。NK细胞体外杀伤HGC的试验显示了NK细胞对HGC具有杀伤效应，且这种杀伤效应可以被相应的配体抗体所抑制。

本研究流式细胞仪检测发现，在蛋白水平、HGC表面的MICA、ULBP2和ULBP3表达率分别为(63.26±6.71)%、(61.23±5.97)%和(51.47±2.43)%，但不表达MICB和ULBP1分子，NKG2D与靶细胞表面的MICA、ULBP2和ULBP3识别、结合而激发的杀伤活化效应可能是NK细胞杀伤HGC的主要机制之一。

在一定限度内，NK细胞对HGC的杀伤活性随着效靶比升高而增强，即随着NK细胞与HGC数量比值的增大，杀伤效应逐步增强，但当效靶比超过50∶1，增加的NK细胞的比例与取得的杀伤效应不成正比。50∶1组和100∶1组比较无显著性差异。这可能与HGC表面配体数量的饱和性有关，即配体的数量是一定的，当配体与受体的识别和结合达到饱和后，增加杀伤受体的数量，不能增加NK细胞的杀伤效应。

用anti-MICA、anti-ULBP2及anti-ULBP3单抗分别阻断HGC表面相应的MICA、ULBP2及ULBP3配体，NK细胞的杀伤活性受到不同程度的抑制，与阻断前相比均有统计学意义(P=0.000)。说明NKG2D与配体间的相互作用确实参与NK细胞对HGC的杀伤效应。同时，抗体阻断试验只是部分阻断NK细胞的杀伤活性，说明除了NKG2D介导的杀伤效应外，尚有其他信号通路参与NK细胞对HGC的杀伤作用。有学者在胶质瘤的体外抑制试验发现了相似的的实验结果。