子宫内膜样癌组织中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表达及其意义

董 杏 李 珍 宿晓晓 林艳丽 杜艳敏 张欢欢 曾宪旭

子宫内膜样癌是原发于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，为女性生殖道三大恶性肿瘤之一[1]。近年来发病率在世界范围内呈上升趋势。据统计2015年中国新发病例63 400例，死亡病例21 800例[2]。子宫内膜样癌的发生机制目前尚未明确，相关研究表明子宫内膜样癌的发生与内源性及外源性雌激素长期刺激关系密切[3-4]。ING4作为ING家族中的一员，是一个肿瘤抑制因子，目前的研究表明，它可通过多种途径来参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡[5]。本研究通过组织芯片及免疫组化方法联合检测，一方面探讨ING4在子宫内膜样癌中的表达，另一方面探讨不同子宫内膜组织中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表达水平，结合临床病理学特征进行分析，为疾病的诊断和预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

该研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，收集了2015年12月至2019年3月于郑州大学第三附属医院因子宫内膜病变行全子宫切除术，术后常规病理确诊为子宫内膜样癌的标本60例(研究组，C组)，按照2009年国际妇产科联盟新修订标准，手术病理分期Ⅰ期40例、Ⅱ期13例、Ⅲ期7例；按照2003年世界卫生组织修订标准，组织学分级高分化28例、中分化17例、低分化15例；无子宫肌层浸润7例、浸润浅肌层者(<1/2)28例，深肌层或浆膜浸润(≥1/2)25例；无淋巴结转移53例，有淋巴结转移7例。另取同时期因其他妇科疾病而进行手术切除的子宫内膜标本为对照组，其中子宫内膜不典型增生的标本30例(B组)以及正常的子宫内膜标本20例(A组)。所有研究对象术前均未接受内分泌治疗或辅助放化疗，且术前肝功能及肾功能指标均在正常范围内。选取患者的年龄为45～79岁，平均53岁。

1.2 实验试剂

免疫组化试剂P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)由美国罗氏诊断产品(上海)有限公司提供；ING4(Cat No.：I0617-I-AP)抗体由武汉三鹰公司提供。DAB显色试剂盒购自上海生工生物工程公司。

1.3 实验方法

1.3.1 组织芯片的制备 首先在HE切片上选定最具代表性的子宫内膜位点，对照石蜡标本进行标记，精确穿刺位点，用1 mm孔径的穿刺针将采集到的组织注入到蜡块阵列中，并对每一个位点进行编号。并按照6×9的序列将其整齐的排列在蜡块上。组织芯片要制平整以免出现组织移位、缺失等，点间距离是0.3 mm。使用Leica2245切片机以4 μm厚度进行连续切片，以备后续实验。

1.3.2 免疫组织化学染色(SP)方法 组织芯片蜡块取4 μm切片在75 ℃恒温烤箱中烘烤30 min后，将石蜡切片放在二甲苯中脱蜡；将脱蜡后的切片进行梯度酒精脱水，自来水冲洗；然后将切片放入EDTA修复液中煮沸、修复；冷却至室温后把切片放入湿盒中用3%过氧化氢封闭；PBS冲洗3次后，滴加按比例稀释的一抗，包括ING4抗体(Cat No.：I0617-I-AP，1：600)，P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)，37 ℃孵育1 h；PBS冲洗3次后，室温下加用相应二抗30 min；DAB显色、复染后用中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

1.3.3 染色结果及判定标准 由2位病理科主任医师在临床和病理资料不知晓的情况下独立观察切片，并进行染色评分，ING4蛋白的阳性表达位于细胞核或胞质，但主要是核表达，以核出现棕黄色细颗粒状着色为标准。阳性结果判定：每张切片随机选取5个视野(×40)，计数 500个细胞，依照细胞染色强度和染色密度作为评分标准：①染色强度根据染色深度分为4级：无染色者为0分、浅黄色为1分，棕黄色者2分，棕褐色者为3分。②依据染色细胞百分比：未见染色细胞为0分，染色细胞比例≤25%者为1分，染色细胞比例在 25%～50%为2分，染色细胞比例≥50%为3分。以上诉两方面之和的总得分来判定结果，≤2分判定为阴性，>2分判定为阳性[6]。

1.4 统计学分析

应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，定性资料应用χ2检验，有序等级资料采用Spearman等级检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同子宫内膜组织中ING4、p53、Ki-67及ER、PR 的表达情况

ING4在A组中表达率最高，在B组和C组中表达率逐渐降低，且三者比较差异有统计学意义。p53、Ki-67蛋白在C组中高表达，表达率分别为63.33%和41.67%；在B组中表达率分别为40.00%和33.33%，A组中表达率分别为15.00%和10.00%，A、B组与C组相比，P<0.05；且A组与B组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。ER、PR在A组、B组、C组中的阳性表达率逐渐下降，且C组与A组及B组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 子宫内膜癌中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表达与临床病理特征的关系

ING4的表达与子宫内膜癌临床病理分期、组织分化程度、肌层浸润深度等病理特征均有关，子宫内膜癌组织、临床分期越晚、分化程度越差、肌层浸润越深者，ING4表达越低，且具有统计学意义(P<0.05)。p53、Ki-67的阳性表达率随子宫内膜癌病理分期、肌层浸润深度的增加有增高的趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)。ER的阳性表达率与分化程度及肌层浸润深度有关(P<0.05)，PR的阳性表达率与病理分期、分化程度以及肌层浸润深度均相关；由于淋巴结阳性样本量较少，未发现上述因子的表达与淋巴结转移之间的相关性，见表2。

表1 ING4、p53 、Ki-67及ER、PR在不同组织中的表达情况(例，%)

注：*表示与子宫内膜癌(C组)比较，P<0.05；#表示与不典型增生子宫内膜(B组)比较，P<0.05。

表2 子宫内膜组织中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的阳性表达与临床病理特征的关系(例，%)

2.3 子宫内膜样癌中ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相关性研究

Pearson相关分析显示：ING4的表达与ER及PR的表达量存在正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。ING4的表达与p53的表达量存在负相关，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相关性(γ)

注：*表示两者相比，P<0.05。

3 讨论

ING4作为ING家族的成员，是一个肿瘤抑制因子，它可以通过不同的途径来参与调控肿瘤细胞的增殖和凋亡，如在结肠癌和胶质瘤细胞中，ING4可通过与NFκB/p65的相互作用导致NFκB/p65蛋白酶体依赖性降解和肿瘤抑制[7-8]。本研究中，ING4蛋白在正常子宫内膜、不典型增生性子宫内膜、子宫内膜样癌中，随着病变程度的增加，ING4的表达逐步降低，与赵倩等[6]研究结果一致。

ING4为抑癌基因，但其真正的作用机制目前尚未清楚，结合其在其他肿瘤中的研究，我们推测ING4可能在子宫内膜样癌的发生发展过程中参与了p53通路的调控，所以本课题致力于探讨ING4在子宫内膜癌中的分子作用机制，并对ING4对肿瘤细胞的增殖、凋亡进行研究分析。本研究发现ING4的表达与p53的表达量存在负相关，差异具有统计学意义。

我们对ING4蛋白的表达与子宫内膜样癌临床病理特征进行分析，结果发现ING4蛋白在子宫内膜样癌组织中，随着肿瘤肌层浸润加深，其表达逐渐降低；Ⅱ～Ⅲ较Ⅰ期的表达下降；低分化组与中高分化组相比，ING4的表达下降。研究者在乳腺癌[9]和前列腺癌[10]中也发现同样的结论，此外ING4在子宫内膜癌和不典型增生中的表达明显下降，提示ING4的基因突变或蛋白表达异常甚至缺失可能参与了启动子宫内膜癌的恶变过程。

Ki-67存在于增殖细胞核基质内，检测Ki-67的阳性率表达常作为评估肿瘤细胞增殖活性的指标[11]。抑癌基因p53编码核磷酸蛋白，具有调节转录、诱导凋亡等多种生物学作用。p53在人类肿瘤中极易发生突变，突变后其正常的抑癌作用消失，细胞将发生恶性转化[12]。我们采用免疫组化方法检测到的p53为突变型p53。Athanassiadou等[13]研究显示，突变的p53可明显增加子宫内膜的癌变率。本研究结果显示，子宫内膜癌组织中p53阳性表达率明显高于对照组患者，且与FIGO 病理分期、分化程度、肌层浸润程度呈正相关，这表明突变的p53可直接反映子宫内膜癌的恶性程度，与肿瘤的发生、肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。

子宫内膜癌发病与雌、孕激素密切相关[4]。研究显示[14]PR、ER 阳性表达的子宫内膜癌患者有更高的5年生存率。PR低表达通常早于 EC 的发生或发生在早期阶段，由此推测由于孕激素无法发挥拮抗ER的作用，促进了ER、PR 表达下调的早期癌变细胞的生存，从而诱发癌变的进一步发生，导致 EC 的发生[15]。本研究显示，ER、PR阳性表达率从正常子宫内膜到癌变的内膜，呈下降趋势，多数情况下为弱阳性表达，在子宫内膜癌中表达降低。ER、PR 在子宫内膜样癌中的阳性率随组织学分级的增高而降低，与肌层浸润深度及分期无关，与徐珂等[16]研究中显示的ER、PR蛋白表达量与 EC 临床分期、组织分化程度存在明显相关性结论一致。此外本研究证实ER、PR在雌激素依赖性子宫内膜癌中呈现出高表达的状态且与P53、Ki-67的表达呈负相关。

综上所述，ING4的表达与子宫内膜癌的发生呈负相关，可作为子宫内膜癌患者的一种可靠的预后指标。P53突变的子宫内膜癌，其瘤细胞分化较差，恶性程度高，提示预后不良。Ki-67阳性也提示子宫内膜癌预后较差。上述指标联合应用可能对子宫内膜癌病理诊断及预后和靶向治疗提供帮助。