骨髓增生异常综合征患者骨髓TIM-3表达水平及意义分析

魏艳利 许莲蓉

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)系由造血干细胞恶性克隆引起的血液系统疾病，可引起造血功能衰竭，严重者可能转化为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，预后差[1]。目前尚未明确MDS发病机制，多认为造血干细胞基因突变、细胞免疫缺陷参与在MDS发病过程，主要表现在造血干细胞恶性克隆、逃离免疫监视方面[2]。T细胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin mucin 3，TIM-3)系细胞表面糖蛋白成分，表达于树突细胞、T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)等免疫细胞表面，同时为免疫负性调节因子，参与肿瘤免疫调控，抑制部分免疫细胞分子表达[3]。报道发现，TIM-3高度表达于大部分亚型AML患者造血干细胞，但在正常造血干细胞基本无表达，认为其与恶性血液病发生有关[4]。但对MDS患者TIM-3表达及意义尚少见报道。为探讨TIM-3在MDS中的表达及其意义，现对75例MDS及20例非MDS进行了研究，报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2016年8月至2018年8月山西医科大学第二医院血液科收治的MDS患者共75例。均符合血液病诊断及疗效标准中MDS诊断及分型标准[5]；经骨髓形态学、活检确诊；完成骨髓细胞免疫表型测定；患者及家属均自愿签署研究同意书，均可配合完成随访调查。其中男性41例，女性34例；年龄20～75岁，平均(56.8±7.1)岁；其中MDS伴单系发育异常(myelodysplastic syndrome-single-lineage dysplasia，MDS-SLD)21例，MDS伴多系发育异常(myelodysplastic syndrome-multiple-lineage dysplasi，MDS-MLD)15例，MDS伴原始细胞增多-1(MDS-excess blasts-1，MDS-EB-1)12例，MDS-EB-2 26例，MDS伴环状铁粒幼红细胞(myelodysplastic syndrome-ring sideroblasts，MDS-RS)1例；核型：较好核型35例，中等核型23例，差核型12例，极差核型5例；国际预后积分系统修订评分(revised international prognostic scoring system，IPSS-R)[6]：低危(<3分)21例，中危(3～4.5分)20例，高危(4.5～6分)15例，极高危(>6分)19例。选择同期收治的20例非MDS但需穿刺抽取骨髓液筛查者作为对照组，其中男性12例，女性8例；年龄21～73岁，平均(55.9±6.9)岁；均自愿采集骨髓标本。研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

消毒铺巾，2%利多卡因局麻，髂后上棘穿刺提取骨髓液5 ml，肝素抗凝并过滤，涡旋振荡器混合均匀，室温避光孵育15 min，加入1 ml溶血素，涡旋振荡器混匀，室温避光孵育10 min，低速离心(1 500 r/min)10 min，弃上清液，加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)1 ml，振荡均匀，低素离心10 min，弃上清，加300 μl重悬，应用美国BD PharMingen公司Aria Ⅱ流式细胞仪分选TIM-3+干细胞(TIM-3+CD34+CD38-Lin细胞群)，检测管内预先加入多甲藻黄素叶绿素蛋白(peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)标记鼠抗人CD34单克隆抗体/别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记鼠抗人CD38单克隆抗体/藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记TIM-3单克隆抗体/Lin异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记鼠抗人Lin单克隆抗体及同型对照单克隆抗体各20 μl，试剂盒均购自美国BD公司，4 ℃避光孵育0.5 h，加红细胞裂解液2 ml，混合均匀，继续室温闭光孵育10 min，PBS洗涤2次，滤网过滤细胞悬液，收集过滤液，上机测定，每管收集500 000细胞，测定CD34+CD38-Lin-TIM-3+细胞比例。参照文献[7]进行骨髓染色体核型分析，核型异常均参照人类细胞遗传学的国际命名体制[8]。所有MDS均从确诊MDS随访至2019年4月1日或患者死亡，通过电话、门诊随访形式，明确其生存状况及是否转化为AML，统计转白率。

1.3 数据分析

应用SPSS 21.0软件分析数据，计数资料行χ2检验，计量资料组间比较t检验，多组比较采用方差分析，组内LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表达情况比较

MDS患者骨髓液CD34+CD38-Lin-TIM-3+细胞比例高于非MDS(P<0.05)，见表1。

表1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表达情况比较

注：①为与非MDS比较，P<0.05。

2.2 不同染色体核型MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

不同染色体核型MDS患者骨髓TIM-3比较差异有统计学意义(F=16.257，P<0.05)，随核型变差TIM-3表达水平上升，见表2。

表2 不同染色体核型MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

注：①为与较好核型比较，P<0.05；②为与中等核型比较，P<0.05；③为与差核型比较，P<0.05。

2.3 不同IPSS-R评分MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

不同IPSS-R评分MDS患者骨髓TIM-3表达比较差异有统计学意义(F=14.364，P<0.05)，随着IPSS-R评分上升，骨髓TIM-3表达增加，见表3。

表3 不同IPSS-R评分MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

注：①为与低危比较，P<0.05；②为与中危比较，P<0.05；③为与高危比较，P<0.05。

2.4 不同亚型MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

不同亚型MDS患者骨髓TIM-3表达差异有统计学意义(F=8.154，P<0.05)，随MDS亚型进展，TIM-3表达增加，见表4。

表4 不同亚型MDS患者骨髓TIM-3表达情况比较

注：①为与MDS-SLD/MDS-RS比较，P<0.05；②为与MDS-MLD比较，P<0.05；③为与MDS-EB-1比较，P<0.05。

2.5 MDS患者骨髓TIM-3表达与转白率及生存率的关系

本组75例MDS患者均随访至死亡或随访截止日，其中转化为AML 24例，转白率为32.00%；随访结束生存68例，死亡7例，MDS转白患者骨髓TIM-3表达水平高于未转白组，随访死亡组骨髓TIM-3表达水平高于生存组(P<0.05)，见表5。

表5 MDS患者骨髓TIM-3表达与转白率及生存率的关系

注：①为与转白组比较，P<0.05；②为与生存组比较，P<0.05。

3 讨论

MDS系造血干细胞异质、克隆分化后产生恶性克隆细胞呈现无效或病态造血，导致造血功能衰竭的血液病，最终可转化为AML，威胁患者生命安全[9]。目前对MDS发病机制的研究主要集中于体内免疫监视系统失衡、造血干细胞遗传变异方面，以细胞免疫缺陷为主[10]。文献报道CD123、CD25、CD96及TIM-3均优先表达于肿瘤干细胞，可能为恶性克隆重要标志物[11]。也有分子学研究发现，TMI仅在肿瘤干细胞呈高表达，有较高的特异性[12]。

TIM-3属TIM家族关键成员，可与磷脂酰丝氨酸结合，促进树突状细胞及巨噬细胞清除凋亡体，诱导细胞免疫耐受，是免疫调控负分子，在肿瘤免疫逃逸中有重要作用。TIM-3配体为半乳凝集素9，在免疫球蛋白可变区其可与TIM-3分子寡聚糖结合，产生免疫负调控作用，导致Th1细胞凋亡及干扰素-γ释放减少，诱导骨髓来源的抑制性细胞增殖，引起免疫抑制。徐良静等[13]发现，TIM-3+白血病细胞可重建于免疫缺陷小鼠体内，但无法在正常小鼠体内重建，认为TIM-3+白血病细胞含白血病干细胞功能。MDS为白血病前状态，但目前对其造血干细胞TIMI3表达及功能尚未见报道。本研究发现，MDS患者骨髓液TIMI3在造血干细胞表达情况明显高于非MDS，且MDS患者骨髓液TIMI3在造血干细胞上表达情况与患者染色体核型、预后评分、亚型均呈现一定的正性相关关系，染色体核型异质性、恶性程度高，预后评分高危及亚型进展MDS患者骨髓液TIMI3在造血干细胞上表达率较高；且随访生存及未转白MDS患者TIMI3在造血干细胞上表达率较随访死亡、转白者低，提示TIM-3可能为MDS造血干细胞恶性克隆的标志物，参与MDS恶性转化过程，且与疾病预后呈密切相关。但对TIM-3在AML造血干细胞高表达率机制尚未明确，考虑增多TIM-3可能为白血病干细胞分子突变所产生的结果，调节髓系分化转录因子突变可能直接对TIM-3转录产生影响，促进TIM-3+细胞呈长生存。

综上，TIM-3可能为AML前状态标志物，在MDS骨髓造血干细胞呈高表达，但在非MDS造血干细胞表达率极低，且MDS患者骨髓干细胞TIM-3随病情进展增加，且与患者不良预后存在密切关联，推测TIM-3+干细胞可能为MDS病程中恶性克隆性细胞，参与病情进展过程。