海红果多糖对D半乳糖衰老模型小鼠骨髓端粒酶逆转录酶的影响

2020-06-13姜爱雯杜佩珊刘云宁张鹤鸣

中国老年学杂志 2020年11期

姜爱雯杜佩珊刘云宁张鹤鸣

(1河北北方学院附属第一医院，河北张家口 075000；2张家口市第一医院)

海红果是蔷薇科苹果属楸子的果实，又名海红、海棠果〔1,2〕，主要分布在晋、陕、蒙三省(区)交界处，是我国西北地区特有的一种果树。海红果营养丰富，具有醒脑提神、去腻除腥的功效〔3,4〕，经常食用可健胃消食，增强食欲，软化血管抗衰老。近年来，海红果多糖(PFM)的提取工艺〔5〕及药用价值也逐步被重视，但PFM的研究远滞后于山楂、香菇、沙棘等〔6～8〕植物类活性成分研究。本文采用实时定量RT-PCR法测定衰老模型小鼠骨髓端粒酶逆转录酶(TERT)的表达，研究PFM对小鼠的抑制作用。

1 材料与方法

1.1药品、试剂及仪器海红果购于内蒙古呼和浩特市清水河县；新鲜成熟海红果洗净、切片、60℃干燥后粉碎备用；黄芪多糖购于北京索莱宝科技有限公司；D-半乳糖购于北京索莱宝科技有限公司；RNaseA试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 试剂盒购于上海浩然生物技术有限公司，其他化学试剂均为分析纯；MX 3000P荧光定量PCR仪由美国安捷伦提供。

1.2实验动物健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重(24±2)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号:SCXK(京)2014-0004。分为正常组，模型组，PFM低、中、高剂量组，黄芪多糖组各10只。

1.3小鼠骨髓中提取RNA 各组动物处死后，立即取新鲜骨髓，骨髓取出后加入1 ml裂解液RZ，迅速放入液氮保存，按下列步骤提取RNA。(1)组织用匀浆仪进行匀浆处理后，将样品在15～30℃放置7 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。4℃、12 000 r/min离心5 min，取上清，转入一个新的无RNaseA的离心管中。(2)加入200 μl氯仿，盖好盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。(3)4℃、12 000 r/min离心10 min，样品分黄色有机相、中间层和无色的水相3层，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步。(4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀。将得到溶液沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃、12 000 r/min离心60 s，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，则分2次转入，4℃、12 000 r/min离心60 s，弃掉收集管中废液。(5)向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RD，4℃、12 000 r/min离心60 s，弃废液。(6)向吸附柱CR3中加入700 μl漂洗液RW，室温放置2 min，4℃、12 000 r/min离心60 s，弃废液。(7)向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW，室温放置2 min，4℃、12 000 r/min离心30 s，去除残余液体。(8)将吸附柱放入2 ml收集管中，4℃、12 000 r/min离心2 min，去除残余液体。(9)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30 μl RNase-free ddH2O，室温放置2 min，4℃、12 000 r/min离心2 min。经微量紫外分光光度计检测总RNA样品OD值在2.0～2.2之间，提取RNA样品予-80℃保存。

1.4骨髓RNA反转录总RNA 3.76 μl，Anchored Oligo(dT)18 1 μl，Random Primer(N9) 1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μl，Rnase-free水20 μl。反转录条件：25℃，10 min；42℃，30 min；85℃，5 min。得到的cDNA样品于-20℃保存待测。

1.5实时荧光定量PCR测定TERT引物的设计待测基因TERT：上游引物5′-ggTTgCCCAATgCCTAgTgTg-3′，下游引物5′-CTCTggCCTCgTTAAgCAgCTC-3′参比基因GAPDH：上游引物5′-TgTgTCCgTCgTCgTggATCTgA-3′下游引物5′-TTgCTgTTgAAgTCgCAggAg-3′。引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物浓度为10 μmol/L。

1.6实时荧光定量PCR反应体系和条件上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA 2 μl，Rnase-free水20 μl。混匀后扩增。扩增条件为：95℃ 2 min 预变性，然后95℃ 2 s，58℃ 20 s，40个循环。应用MX 3000P荧光定量PCR仪进行检测、记录和分析。

1.7标准曲线制备用实时定量PCR仪扩增任意一份待测样品，以10倍梯度稀释模板的实验数据作标准曲线，共5个浓度，每个稀释样品重复3次。

1.8测定样品数据的计算方法稀释10倍后的待测样品cDNA取1 μl加入实时荧光定量PCR反应体系中，每份样品分别测定TERT基因及GAPDH基因的Ct值，重复3次，取平均值。以2-△△Ct计算各组相对值。

1.9统计学方法应用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结果

2.1端粒酶和GAPDH基因的标准曲线样品梯度稀释后和TERT引物扩增所得到得标准曲线r2=0.992，斜率=-3.177，GAPDH基因扩增后得到的标准曲线r2=1.000斜率=-3.179。说明线性关系良好，扩增效率高。基因线性关系和熔点曲线见图1。

图1 TERT及GAPDH基因曲线图

2.2基因测序结果将电泳条带胶用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 试剂盒回收，送大连宝生物公司测序，将测得序列与经GenBank上的BLAST比对分析，与理论序列完全一致。

2.3实时荧光定量PCR结果分析与正常组(1.019±0.073)相比，模型组TERT mRNA表达(0.445±0.103)明显减少(P<0.01)；与模型组相比，PFM低、中、高剂量组和黄芪多糖组(0.810±0.160、0.817±0.014、1.382±0.011、1.180±0.012)显著增加(P<0.01)。