黄芩素对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及对Janus激酶-信号转导与转录激活分子信号通路的影响

王家伟 易登良 王涛 高毅滨

(1西南医科大学附属医院心血管内科，四川 泸州 646000；2泸州市人民医院心内科)

黄芩为唇形科多年生草本植物,根入药,是我国传统中药，首载于《神农本草经》，具有清热燥湿、泻火清心、凉血活血等功效。现代药理学研究表明〔1～3〕，黄芩具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛、抗炎、抗氧化、免疫抑制、神经保护等多种药理作用。黄芩素是从黄芩的干燥根中分离得到的一类黄酮类化合物，也是黄芩的主要活性成分。多项研究表明〔4～6〕，黄芩素对心血管具有良好的调节作用，并对心肌缺血再灌注(I/R)损伤有保护作用，由于I/R损伤病理机制复杂，黄芩素对I/R损伤保护作用的具体机制并非缺乏深入研究。近年来Janus激酶(JAK)-信号转导与转录激活分子(STAT)被证实参与人体内病理生理反应,在多种疾病的发生发展起关键作用〔7〕。JAK/STAT信号通道也参与I/R损伤的病理过程，过度激活的JAK-STAT信号通路也会引起相关细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及IL-6水平的变化及相关调控细胞状态蛋白Bcl-2和Bax表达的变化〔8〕。本研究制备大鼠冠脉左前降支结扎释放的I/R损伤模型，观察黄芩素对I/R损伤的保护作用，并通过观察相关指标的变化探讨其对JAK-STAT信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1动物 50只SPF级SD雄性大鼠，4周龄，体重220～260 g，平均(245.0±10.4)g，选于西南医科大学动物实验室，动物生产许可证号 SCXK(京)2012-0001。在温度22～25℃及相对湿度55%～60%条件下饲养于西南医科大学实验动物中心清洁级动物房，自由摄食饮水。

1.2药物、试剂及主要仪器 黄芩素由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，CAS号：491-67-8，实验前配制成所需浓度溶液使用；AnnexinV-FITC/PI，德国Roche公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)染料，北京索莱宝生物科技有限公司， 批号为 20180202；IL-6、IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)测试盒，南京建成生物工程研究所；Bax、Bcl-2抗体、抗人磷酸化(p)-JAK2抗体、抗人p-STAT3抗体，美国Cell Signaling Technology公司；MeditecAG双目显微镜，德国Zeiss公司；MULTISKANMK3型酶标仪，美国Thermo公司；离心机型，德国Eppendorf型；ChemiDocTMXRS+凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司。

1.3动物分组及给药 50只大鼠用普通饲料适应性饲养1 w后，随机分为正常对照(C)组、假手术对照(S)组、模型(IR)组、黄芩素低剂量(L)组和黄芩素高剂量(H)组，每组10只。C组、S组、IR组给予生理盐水2 ml/d连续7 d腹腔注射；L组给予黄芩素0.4 mg/(kg·d)(0.4 mg黄芩素粉溶解于2 ml生理盐水)连续7 d腹腔注射，H组给予黄芩素1.2 mg/(kg·d)(1.2 mg黄芩素粉溶解于2 ml生理盐水)腹腔注射7 d，IR组、H组、L组再连续注射7 d。C组不做处理，S组行假手术处理，IR组、H组、L组进行大鼠I/R模型制备。

1.4I/R模型制备 S组、IR组、H组、L组连续注射7 d,末次给药后30 min，参照《药理实验方法学》〔9〕建立大鼠I/R模型，首先对大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，采用仰卧位固定至手术台，气管插管，连接动物人工呼吸机和心电图仪。用医用酒精进行胸部消毒，从胸骨左侧第3～4肋间水平横行切口，逐层分离组织，打胸腔及心包膜，向右上方暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥之间分离出冠状动脉左前降支，于左心耳下缘2 mm处穿线对冠状动脉左前降支进行结扎(S组只穿线不结扎)，形成活结，同时活结放置软管，拉紧活结阻断冠脉左前降支供血，以心电图出现ST段抬高为结扎成功标志。结扎40 min后轻轻打开活结扎线，以心电图出现ST段抬高断下降为复灌成功标志，恢复血液灌注90 min后，即为大鼠I/R损伤模型。

1.5TTC法评价心肌梗死率 复灌90 min后取心脏，用4℃生理盐水清洗干净，用吸水纸吸去水分，剪取心室并称其质量，将心室从心尖至心底切成1.0～2.0 mm组织切片，置于1% TTC磷酸缓冲溶液，于37℃条件染色5 min。梗死心肌呈白色，非梗死心肌为深红色，将坏死区与非坏死区分离，称取白色部分质量。得出心肌梗死率，心肌梗死率=苍白区质量/心室质量×100%。

1.6血清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平的测定 在造模前及再灌90 min后由腹主动脉各取血2 ml，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清，按照ELISA操作及试剂盒说明书，测定造模前及复灌90 min后血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量水平。

1.7实时荧光定量PCR检测心肌细胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3基因表达 ①心肌细胞总RNA提取;②逆转录;③PCR反应，反应程序：94℃预变性2 min，94℃ 45 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，循环40次；以β-actin 为内参照，用2-△△Ct法获得心肌细胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3基因mRNA相对水平。各基因引物扩增序列：β-actin上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,Bax:上游:5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′,下游:5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′;Bcl-2上游5′-CCGGGAGATCGTGATGAAGT-3′,下游:5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′;JAK2上游:5′-AAGCATGTGGTATTACGCCTGTG-3′,下游:5′-CCTGGTTGACTCATCTATGTGGAAG-3′;STAT3上游:5′-GAGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3′,下游:5′-CAGGTCGTTGGTGTCACACA-3′。

1.8心肌组织中Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平测定 取各组心肌组织，用裂解液将组织裂解，组织匀浆器搅匀，37℃孵育5 min，12 000 r/min离心10 min。收集细胞并抽提蛋白，以二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法检测总蛋白浓度，取50 μg蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，电转移至硝酸纤维素(PVDF)膜上，5%BSA的TBST封闭2 h，分别加入一抗鼠抗人Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3单克隆抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入相应辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜后，电化学发光(ECL)发光液显色，用凝胶扫描系统曝光及图片扫描成像，以 β-actin 为内参照，实验重复3次，采用Image J分析软件计算分析，获得各蛋白相对表达量。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1TTC 法测定黄芩素对大鼠I/R心肌梗死率的影响 染色结果显示，坏死心肌呈灰白色，非坏死区心肌呈深红色，C组和S组未见灰白色坏死心肌，IR组、H 组、L组出现大小不等的灰白色坏死心肌，进一步表明造模成功;通过对梗死面积的统计分析发现，与IR组比较，H 组、L组灰白色坏死心肌均明显减少(P<0.05); H组比L 组作用更明显(P<0.05)。因此，黄芩素可显著降低I/R损伤大鼠的心肌梗死率(P<0.05)，见图 1，表1。

图1 各组心肌梗死面积(×50)

表1 各组心肌梗死率比较

与S组比较:1)P<0.05；与IR组比较:2)P<0.05；与L组比较:3)P<0.05；同表3，表4

2.2各组血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平比较 造模前，各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)；与S组比较，IR组、L组、H组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显增加(P<0.05)；与IR组比较，L组、H组血清中IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)，而黄芩素对IL-1β细胞因子无显著影响；与L组比较，H组TNF-α及IL-6水平显著降低(P<0.01)。见表2。

组别时间IL-6IL-1βTNF-αC组未处理11.42±2.9529.77±2.2024.93±2.02S组假手术前10.66±2.8928.30±2.0125.78±2.0690 min11.45±3.3027.02±1.5023.63±1.83IR组造模前12.78±2.3628.65±1.5824.66±2.3090 min345.38±98.711)2)45.44±2.291)2)173.45±50.291)2)L组造模前12.36±3.3428.02±3.0623.78±2.5490 min288.37±65.301)2)3)47.48±3.301)2)116.23±43.301)2)3)H组造模前10.39±2.8129.66±2.4426.45±3.0290 min218.65±57.251)2)3)4)48.69±2.791)2)96.69±28.421)2)3)4)

与造模前比较:1)P<0.05；与S组比较:2)P<0.05；与IR组比较:3)P<0.05；与L组比较:4)P<0.01

2.3各组心肌细胞中Bcl-2、Bax、JAK2和STAT3基因表达 C组与S组Bcl-2、Bax、JAK2和STAT3基因mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；IR组、L组、H组心肌细胞中Bax、JAK2和STAT3基因mRNA均显著高于S组，而Bcl-2基因mRNA显著低于对照组(P<0.05)，L组、H组Bax、JAK2和STAT3基因mRNA表达量显著低于IR模型组(P<0.05)，而H组Bcl-2基因mRNA显著高于IR组，见表3。

组别Bcl-2 mRNABax mRNAJAK2 mRNASTAT3 mRNAC组2.03±0.100.59±0.090.30±0.120.43±0.10S组2.12±0.110.61±0.100.29±0.110.41±0.10IR组0.81±0.091)2.65±0.281)1.80±0.191)2.77±0.281)L组0.79±0.081)2)2.57±0.271)2)1.61±0.181)2)2.57±0.251)2)H组1.21±0.071)2)3)1.95±0.211)2)3)1.51±0.071)2)2.45±0.231)2)3)

2.4各组心肌细胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达比较 C组与S组Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)；IR组、L组、H组与S组比较，Bcl-2蛋白表达量显著下降，Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量明显增加(P<0.05)；L组、H组Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量显著低于IR组(P<0.05)，而H组Bcl-2蛋白显著高于IR组(P<0.05)。见图2，表4。

图2 各组心肌细胞Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达比较

组别Bcl-2/β-actinBax/β-actinp-JAK2/β-actinp-STAT3/β-actinC组2.48±0.300.56±0.090.25±0.120.28±0.13S组2.55±0.220.54±0.100.20±0.090.25±0.10IR组0.95±0.091)2.41±0.181)1.81±0.191)2.39±0.191)L组0.94±0.081)1.92±0.171)2)1.35±0.151)2)1.56±0.171)2)H组1.58±0.071)2)3)1.71±0.171)2)3)1.21±0.111)2)3)1.41±0.141)2)3)

3 讨 论

随着现代社会发展与人民生活方式的转变，我国疾病谱也在逐渐发生变化。调查显示〔10〕，近十年来，心血管病已成为我国城乡居民的第1位死因，其死亡人数占总死亡人数45%。其中，冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发病率逐年升高，严重的心肌梗死频发，死亡率上升，由于缺乏较好的治疗方法与技术〔11,12〕，目前，需要一种安全有效的治疗技术及药物〔13〕。临床治疗急性心肌梗死常用紧急溶栓、冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮冠状动脉介入术(PCI)及护理康复训练等治疗方法〔14～16〕，以恢复血流供应，从而确保缺血组织再供血，及时挽救缺血组织，然而若缺乏及时治疗，极易导致心肌细胞凋亡坏死、心功能障碍及恶性心律失常损伤，即I/R损伤。心肌一旦损伤，微血管阻塞，即使血管再通，缺血组织的微循环血流也不能完全恢复，即无复流现象，这些无复流是造成心绞痛、恶性心律失常和心源性死亡的关键因素。因此，研究心脏再灌注损伤机制和心肌保护是当今诸多学者研究追踪的热点〔17～19〕。

缺血再灌注损伤病理机制复杂，涉及多种病理生理过程，如能量代谢障碍、钙超载、氧化应激、心肌细胞凋亡、自噬、血管无复流现象〔20～22〕等。其中有多种细胞机制、细胞通路和细胞因子参与:ATP敏感钾通道(KATP)、基质金属酶(MMPs)、Fas 信号通路、血管紧张素(ANG)Ⅱ、Toll样受体、磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K/Akt)、JAK-STAT信号通路、丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)、核因子(NF)-κB、细胞因子，如IL、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、生长激素(GH)等〔23〕，这些信号与心脏细胞的增殖、分化和凋亡密切相关。其中JAK-STAT途径越来越多被证明是细胞缺血再灌注损伤中引起凋亡信号通路的关键所在〔24〕。JAK蛋白是一类非跨膜型的酪氨酸激酶，目前发现JAK家族共有4个成员:JAK1、JAK2、JAK3及Tyk2。在细胞信号传导和转录激活过程中STAT发挥了关键性作用〔25〕。在细胞病理生理过程中，当细胞因子与相应的受体结合时引起受体分子的二聚化，激活与受体耦联的JAK，进而活化STAT蛋白，活化的JAK-STAT信号作为信号载体，进入细胞核内与靶基因结合，从而调控基因的转录。在细胞信号传导过程中，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK，一种JAK可以参与多种细胞因子的信号传导过程。机体中过度激活的JAK-STAT信号通路将会引起相关细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平的变化及相关调控细胞状态的蛋白Bcl-2和Bax表达的变化。本研究发现I/R造成对JAK-STAT信号通路的激活，而黄芩素能够部分抑制JAK-STAT信号通路的激活。I/R损伤造成血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平升高，也导致心肌细胞Bax基因表达升高，Bcl-2基因表达降低，而黄芩素处理大鼠对TNF-α、IL-6、Bax、Bcl-2指标均有影响。王庆高等〔26〕研究表明，JAK-STAT信号通路与炎症反应具有明显的相关性， JAK-STAT信号通路与炎症因子的具体影响机制及黄芩素对大鼠I/R损伤具有保护作用是否通过抑制JAK-STAT信号通路造成有待进一步研究。此外，有研究表明〔27〕，黄芩素具有通过抑制过表达 LncRNA AK021954 基因从而抑制血管平滑肌细胞增殖；吕岩等〔28〕研究表明，黄芩素可通过抗氧化、减少心肌酶的漏出机制对大鼠I/R损伤有保护作用；李爽等〔29〕研究表明，黄芩素通过抗氧化和抗凋亡两种机制对大鼠I/R损伤有保护作用。总之，黄芩素对大鼠I/R损伤保护作用具有多靶点和多机制作用。

综上，黄芩素对大鼠I/R损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制JAK-STAT信号通路过度激活从而产生对大鼠I/R损伤的保护作用。由于本研究仅初步对黄芩素药理作用进行研究，其进一步的药理作用机制及病理毒理学影响有待深入研究。