吲哚-3-甲醇灌胃对小鼠变应性鼻炎治疗作用观察

郝婷婷，倪伟，鲁海涛，李琳芸

1 长江大学医学院，湖北荆州 434000；2 长江大学第二临床医学院

变应性鼻炎(AR)是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一，是机体接触变应原后主要由IgE 介导的鼻黏膜变态反应性疾病，主要症状有鼻阻、鼻痒、阵发性喷嚏及流清涕等[1]。AR是 Th1/Th2 型免疫应答失衡型炎症反应，其免疫病理学特征是鼻黏膜组织中大量表达 Th2 型细胞因子(IL-4，IL-5，IL-18)的细胞浸润[2]。近年AR发病机制不仅限于Th1/Th2细胞调节不平衡模式，现有研究发现，Tregs/Th17调节不平衡模式也是AR发病机制之一[3]。肠道微生物群可调节小肠固有层中辅助性T17细胞与T调节细胞之间的平衡[4]。肠道微生物群对AR影响的研究越来越多。色氨酸是一种营养必需氨基酸，具有促进肠蛋白合成和调节紧密连接蛋白和肠转运蛋白表达的作用，以促进人和动物的肠黏膜屏障功能[5]。色氨酸细菌代谢主要代谢产物是吲哚类。Narendra等研究[6]发现，膳食吲哚能通过调节microRNA诱导促炎Th17细胞向抗炎Tregs转变，从而抑制迟发性超敏反应。吲哚-3-甲醇(I3C)是否对AR有治疗作用目前并无文献报道，2018年8月～2019年12月，本研究观察了色氨酸代谢产物I3C灌胃对AR小鼠的治疗作用，并探讨了其作用机制，为AR的治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器 动物：BALB/c小鼠，鼠龄5～8周，来自三峡大学动物中心，小鼠均为SPF级别，并在三峡大学实验动物中心进行 SPF 级别环境饲养，小鼠饲料均为 SPF 级别。试剂：卵清蛋白(OVA)和I3C、ANTI-MOUSE FOXP3 PE、MOUSE IgG2a、ANTI-MOUSE IL-17AF PE、ANTI-MOUSE CD4 FITC均购于Singma公司。仪器:高速冷冻离心机购自德国 Eppendorf 公司；石蜡包埋机、组织冰冻机、石蜡切片机、显微镜购自德国Leica公司；流式细胞仪购自广州誉维生物科技仪器有限公司； 涡旋振荡仪购自金坛市医疗仪器厂；高压蒸汽灭菌锅购自上海博讯实业有限公司。

1.2 动物分组、AR动物模型的建立及I3C灌胃 将BALB/c小鼠随机分成6组：干预1组、干预2组、干预3组、干预对照组、模型组、正常组。干预组、干预对照组、模型组小鼠腹腔注射0.05 mg OVA及5 mg AL(OH)3加入1 mL生理盐水混匀，隔天1次，连续7次。第15天开始激发试验，以5% OVA溶液双侧鼻腔点鼻，0.02 mL/侧，1次/d，连续7次[7，8]。正常组用等量的生理盐水处理。干预1、2、3组建模成功后用不同浓度的I3C 0.8、0.4、0.2 mg/d混合在橄榄油与无水乙醇(橄榄油：无水乙醇=4∶1)中灌胃，0.05 mL/只，干预对照组建模成功后用等量橄榄油和无水乙醇灌胃，1周后观察小鼠行为学，处死后检测相关指标。正常组和模型组建模成功后观察小鼠行为学表现，15 min后处死小鼠，检查相关指标。

1.3 各组临床症状及组织病理观察 最后一次鼻腔激发后观察小鼠15 min，观察小鼠鼻部症状，如喷嚏、流涕、抓痒等行为及严重程度，进行评分[9]。AR评分标准为末次激发致敏15 min内，对小鼠喷嚏个数、鼻腔分泌物量、抓鼻次数进行统计及评分。①喷嚏：1～3个计1分，4～10个计2分，11个及以上计3分；②流涕：前鼻孔有分泌物计1分，鼻分泌物超过前鼻孔计2分，面部布满鼻分泌物计3分；③抓鼻：轻微搔鼻几次计1分，双爪反复搔鼻计2分，搔鼻面部不止，四处摩擦计3分。总分>5分，建模成功。

将小鼠鼻前部组织用4%多聚甲醛固定，多层脱水后制作石蜡切片，进行HE染色，观察组织病理学变化。

1.4 各组外周血Tregs、Th17细胞及血清IL-10、IgE的检测 外周血中Tregs、Th17细胞的检测采用流式细胞术。取小鼠眼球全血后加入红细胞裂解液，获取沉淀的白细胞，随后加入CD4+抗体，避光孵育30 min，洗涤后加FOXP3固定/破膜工作液，避光孵育18 h，再经过透化液、破膜液洗涤后，加入FOXP3抗体避光孵育以后，流式细胞检测仪检测Tregs。而同样加入CD4+抗体后，加入IC固定液固定细胞后，加入IL-17抗体避光孵育20～60 min后，流式细胞检测仪检测Th17。血清IL-10、IgE的检测采用ELISA 法。小鼠眼球取血，将取出血液静置2 h左右，1 500 r/min离心，吸取上清后，严格按照ELISA试剂盒步骤操作，检测血清IgE、IL-10。

2 结果

2.1 各组症状评分及病理学表现比较 干预1组、干预2组、干预3组、干预对照组、模型组、正常组症状评分分别为(1.67±0.82)、(1.75±0.71)、(1.71±0.76)、(7.80±0.84)、(7.29±1.11)、(1.08±0.84)分。与正常组比较，模型组、干预对照组症状评分升高(P均<0.05)。 与模型组比较，干预1、2、3组症状评分降低(P均<0.05)。干预对照组、模型组比较，P>0.05。干预1组、干预2组、干预3组组间两两比较，P均>0.05。正常组鼻前部组织结构完整，上皮细胞排列整齐，无明显的炎性细胞浸润。模型组和干预对照组鼻前部组织结构紊乱，间质见充血及增生，见大量炎性细胞增生。干预1组、干预2组、干预3组的小鼠与正常组小鼠鼻前部组织一样，见少许散在炎性细胞，较对照组和模型组明显减少。各组鼻前部组织病理表现见图1。

注：A为正常组,无明显炎性细胞； B为建模组，C为干预对照组，鼻腔黏膜见明显炎性细胞浸入，图中箭头所指为炎性细胞；D、E、F分别为干预1组、干预2组、干预3组,黏膜见少许散在炎性细胞。

图1 各组鼻前部组织病理变化(HE染色，200×)

2.2 各组Tregs、Th17细胞所占百分比及血清IL-10、IgE水平比较 干预1组、干预2组、干预3组、干预对照组、模型组、正常组Tregs所占百分比分别为1.48%±0.56%、1.95%±0.58%、1.46%±0.46%、0.36%±0.15%、0.27%±0.10%、1.51%±0.40%，Th17细胞所占百分比分别为0.54±0.14、0.66±0.09、0.37±0.24、1.20±0.20、1.46±0.41、0.46±0.16。与正常组比较，模型组、干预对照组Tregs所占百分比降低、Th17细胞所占百分比升高(P均<0.05)。与模型组比较，干预1、2、3组Tregs所占百分比升高、Th17细胞所占百分比降低(P均<0.05)。干预对照组与模型组Tregs、Th17细胞所占百分比比较，P均>0.05。干预1、2、3组之间Tregs、Th17细胞所占百分比两两比较，P均>0.05。

干预1组、干预2组、干预3组、干预对照组、模型组、正常组IL-10分别为(49.94±6.22)、(43.86±7.43)、(48.54±7.66)、(31.32±8.63)、(37.66±7.11)、(55.31±8.09)pg/mL，血清IgE分别为(293.03±41.61)、(280.03±58.48)、(259.74±58.66)、(400.36±61.36)、(343.63±57.59)、(217.66±56.14 )ng/mL。与正常组比较，模型组、干预对照组血清IL-10水平降低、IgE水平升高(P均<0.05)。与模型组比较，干预1、2、3组血清IL-10水平升高、IgE水平降低(P均<0.05)。干预对照组与模型组血清IL-10、IgE水平比较，P均>0.05。干预1、2、3组之间IL-10、IgE水平两两比较，P均>0.05。

3 讨论

随着社会发展、环境变化以及人类饮食的改变，微生物的免疫刺激与特应性反应类型存在联系。此外，人类的营养也发生了很大变化，肠道与免疫之间的关系越来越被关注。AR的发生与肠道内色氨酸的细菌代谢产物关系越来越密切。益生菌已经被证实可以预防和改善消化系统疾病，如急性、医院和抗生素相关腹泻；过敏性疾病，如特应性皮炎(湿疹)和婴儿变应性鼻炎。而肠道内色氨酸的细菌代谢产物也能影响菌群的改变，可能也有跟益生菌类似作用。

本研究中我们观察到模型组小鼠在症状评分和IgE的表达上都明显高于正常组，说明用OVA及氢氧化铝佐剂腹腔注射滴鼻致敏小鼠能建立良好的AR动物模型。进一步研究观察到模型组较正常组Th17细胞百分比升高，Tregs百分比降低，证实Tregs/Th17失衡是AR发病的重要因素。Huang等[10]通过检查6例健康者和14例AR患者血液中Tregs和Th17细胞所占百分比，发现AR患者中Tregs百分比明显低于健康者，而Th17细胞百分比明显高于健康者。由此可知，AR的发生与Tregs/Th17调节平衡存在相关联系。国外相关研究[11]证实，AR患者血清IL-17表达水平与临床症状严重程度呈正相关。本研究中模型组较正常组外周血中IL-10水平明显下降，其原因是Tregs有分泌IL-10的功能，在模型组Tregs细胞减少，IL-10分泌也减少。IL-10是一种重要作用的抗炎因子，能下调单核细胞表面的主要组织相容性抗原的表达，进而降低抗原呈递作用，在变态反应中该物质可以调节效应细胞，参与免疫耐受维持作用[12]。因此，在AR患者中Tregs/Th17失衡而导致IL-10分泌减少可能是发病一个重要因素。

在我们用I3C对建模成功的小鼠进行干预后， I3C干预的小鼠症状评分及外周血液中IgE明显低于干预对照组及模型组，同时在各组小鼠鼻前部组织黏膜病理变化中，也发现干预组鼻腔黏膜炎症细胞少于干预对照组及模型组，说明I3C对AR可能是有一定的治疗作用。进一步研究发现，干预各组小鼠外周血中Tregs百分比较干预对照组和模型组明显增高，与干预对照组比较，干预组Th17细胞百分比下降，血清IL-10上升。推测I3C是通过调节Tregs/Th17，影响IL-10的分泌，从而对AR起到了治疗作用。而干预1、2、3组各组之间的IgE、IL-10以及Tregs、Th17细胞比较差异无统计学意义，提示一定范围内不同浓度的I3C对IgE、IL-10以及Tregs、Th17细胞的影响差异性不大。

总之，I3C可能通过增加Tregs百分比和降低Th17细胞百分比来调节AR小鼠血液中的Tregs/Th17平衡，减少IgE分泌、增加IL-10分泌，以抑制小鼠过敏反应，改善临床症状及组织病理学。本研究为AR的治疗提供了一种新的选择，但具体能否应用于临床仍需临床试验验证。