寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎的活性成分、靶基因筛选和生物学功能分析

吉米丽汗·司马依，买买提明·努尔买买提，季志红，艾尼瓦尔·吾买尔，买尔旦·玉苏甫，周文婷*

1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2新疆医科大学维吾尔医学院；3新奇康药业股份有限公司

寒喘祖帕颗粒是新疆中医药-民族医药之一，由小茴香、芹菜子、神香草、玫瑰花、芸香草、荨麻子、铁线蕨、胡芦巴和甘草浸膏等9味药材组成，载于中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册，其功效是镇咳、化痰、温肺止喘[1～2]。临床研究[3～6]报道，寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎能快速缓解临床症状，提高治疗有效率。寒喘祖帕颗粒作为复方，其药味多、成分较多、药理作用复杂，目前寒喘祖帕颗粒作用于毛细支气管炎的药理作用机制尚未系统阐明。网络药理学是新药发现的先进途径，可系统地解释药物对疾病的作用机制。2019年10月～2012年12月，本研究通过网络药理学方法系统地揭示寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎的活性成分及活性成分靶基因，探讨寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎靶基因的生物学功能及相关信息通路。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件 TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD 三大数据库的蛋白质综合数据库)； Uniprot数据库。DAVID(版本：6.8)数据库(https://david.ncifcrf.gov/，是全面提供功能注释、可视化和集成发现的工具)。DiSGeNET(http://www.disgenet.org/)CTD(http://ctdbase.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca)数据库。String(版本：11.0)数据库(https://string-db.org，搜索已知蛋白和预测蛋白之间相互作用的系统)。PubChem数据库(包括有机小分子生物活性数据的及化学模组的数据库)。PDB数据库(https://www.rcsb.org，是蛋白质、多糖、核酸、病毒等生物大分子的三维结构的数据库)。Cytoscape(版本：3.7.1，是一款图形化显示复杂网络并进行分析和编辑的软件)。

1.2 寒喘祖帕颗粒药材活性成分的筛选、活性成分靶基因的预测及药材—活性成分—靶基因网络构建 通过TCMSP数据库收集寒喘祖帕颗粒9味药材的化学成分。收集所得的所有化学成分通过药物口服生物利用度(OB)、Caco-2 细胞渗透性、血脑屏障(BBB)等ADME参数的限制对其中可能的活性成分进行筛选、分析。寒喘祖帕颗粒9味药材活性成分的筛选标准参照文献[7～8]：OB≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4为药物的生物活性成分。

找到寒喘祖帕颗粒药材生物活性成分后，通过TCMSP数据库收集寒喘祖帕颗粒9味药材活性成分对应的靶基因。然后，将所有靶基因通过Uniprot数据库以“Homo sapiens”(人属)为关键词进行基因—蛋白名称转化，即将全部蛋白名称转换为基因名称。并将寒喘祖帕颗粒的药材、活性成分和靶基因通过Cytoscape3.7.1软件构建药材—活性成分—靶基因网络图(HB-cC-cT Network)。网络拓扑参数自由度(Degree)代表在蛋白相互作用网络中与该节点直接相互作用的节点的数目。节点的大小与度数成正比。节点的度越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强[9]。

1.3 毛细支气管炎发病相关靶基因的筛选及药物-疾病共同潜在靶基因的筛选 以 “Bronchiolitis” 作为关键词，对4大常用数据库(包括CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank)进行已知的毛细支气管炎发病相关靶基因的检索及筛选，并删除检索结果中重复的靶基因，获得毛细支气管炎发病过程已知的靶基因。然后将毛细支气管炎的发病相关靶基因通过String数据库进行蛋白—蛋白相互作用分析。对置信度(Score)得分设定阈值，对蛋白相互作用进行筛选[10]。以Score≥0.9和“Human Sapiens”为关键词筛选得到毛细支气管炎发病相关的主要靶基因，并构建成蛋白—蛋白相互作用的网络图。将毛细支气管炎发病相关主要靶基因与寒喘祖帕颗粒活性成分靶基因进行交集，得到药物-疾病共有的潜在靶基因，并用Cytoscape3.7.1软件构建药材-潜在成分-潜在靶基因网络图(HB-pC-pT Network)。

1.4 寒喘祖帕颗粒—毛细支气管炎共同潜在靶基因生物学功能及信号通路分析 将寒喘祖帕颗粒-毛细支气管炎共同潜在靶基因通过DAVID数据库进行GO基因功能(P≤0.01)和KEGG通路分析(FDR，错误发现率≤0.01)。P值和FDR在富集分析中越小，代表富集显著程度越高。

2 结果

2.1 寒喘祖帕颗粒9味药材的成分、活性成分及活性成分靶基因、药材-活性成分-活性成分靶基因网络 寒喘祖帕颗粒的9味药材收集到240个成分，分别为甘草115个、玫瑰花42个、小茴香26个、葫芦巴12个、芸香草12个、神香草12个、芹菜籽8个、荨麻子7个和铁线蕨6个。将240个成分以OB≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4为标准进行筛选得到14个可能的活性成分，分别为β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、柠檬烯(Limonene)、咖啡酸(Caffeic acid)、β-胡萝卜素(Beta-carotene)、山奈酚(Kaempferol)、茴脑(Anethole)、HEX、Heptan、(L)-alpha-Terpineol、3-methylhexane和齐墩果酸(Oleanolic acid)，详见表1。

表1 寒喘祖帕的可能活性成分

14个活性成分对应385个相关靶基因，删除重复的靶基因名称后得到197个靶基因。药材、活性成分和靶基因之间的关系网络由220个节点(9个药材、14个活性成分和197个活性成分靶基因)和419个边缘组成。从靶基因角度分析，PTGS2(Prostaglandin G/H synthase 2)、NCOA2(Nuclear receptor coactivator 2)、CASP3(Caspase-3)、JUN(Transcription factor AP-1)、CASP9(Caspase-9)、PTGS1(Prostaglandin G/H synthase1)、HSP90AA1(Heat shock protein HSP 90 alpha)、GABRA1(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1)、CHRM1(Muscarinic acetylcholine receptor M1)和HMOX1(Heme oxygenase 1)等靶基因的Degree比较大。从成分角度分析，槲皮素(degree=143)、山奈酚(degree=59)、木犀草素(degree=54)、β-谷甾醇(degree=36)和β-胡萝卜素(degree=22)等成分的节点度比较大。

2.2 毛细支气管炎发病相关的特异性靶基因及药物-疾病共有潜在靶基因 CTD、TTD、DrugBank、DiSGeNET分别检索到377、0、2、65个毛细支气管炎发病过程中相关的靶基因，删除重复靶基因，共检索到419个已知的毛细支气管炎发病相关的靶基因。String数据库筛选得到214个毛细支气管炎发病相关特异性靶基因。将214个疾病特异性靶基因与靶基因进行交集，得到50个寒喘祖帕颗粒—毛细支气管炎共有的潜在靶基因。

2.3 寒喘祖帕颗粒—毛细支气管炎疾病共有潜在靶基因 寒喘祖帕9味药材的8个潜在成分作用于50个毛细支气管炎发病相关特异性靶基因。50个潜在毛细支气管炎发病相关特异性靶基因中VEGF、BCL2、TNF、IL2、TGFB1、HMOX1、MMP2、CASP3、RELA、NFKB1A等靶基因可能是寒喘祖帕颗粒发挥治疗毛细支气管炎作用的潜在靶基因。HB-pC-pT网络见图1。

注：八角形代表9味药材；四角形代表8个潜在成分；圆形代表50个潜在靶基因

图1 HB-pC-pT 网络图

2.4 寒喘祖帕颗粒-毛细支气管炎共同潜在靶基因生物学功能及信号通路 50个寒喘祖帕颗粒-毛细支气管炎共同潜在靶基因 GO基因功能分析结果显示，前10个基因功能包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、炎症反应、免疫反应、凋亡过程、ERK1和ERK2级联的正调节、体液免疫反应、上皮细胞增殖的正向调节、炎症反应的阳性调节、蛋白质磷酸化、细胞因子分泌的正向调节。

共收集21条主要信号通路。包括HIF-1信号通路、TNF信号通路、cAMP信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB 信号通路、T和B细胞信号通路、P53信号通路、细胞凋亡、Jak-STAT信号通路、FoxO信号通路、RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路等15条与产生炎性免疫反应有关的信号通路，催乳素信号通路、神经营养素信号通路、鞘脂信号通路、趋化因子信号通路、雌激素信号通路和GnRH信号通路等6条神经、内分泌相关的通路。其中NF-κB信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll 样受体信号通路、JAK/STAT信号通路、FoxO信号通路、NOD 样受体信号通路等7条信号通路与毛细支气管炎密切相关。

3 讨论

毛细支气管炎是常见的儿童下呼吸道感染，由病毒感染引起的，最常见的病原体为呼吸道合胞体病毒(RSV)[11]。RSV病毒通过破坏气道上皮细胞间紧密连接，促进黏膜蛋白的分泌，影响气道上皮细胞的屏障功能[12]。气道上皮细胞间的顶端连接复合物与其表面的黏液层构成了抵御病原微生物入侵的屏障。参与黏附连接的主要有上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、β- 连环蛋白(β-catenin)及α-连环蛋白(α-catenin)[13]。

为寻找寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎活性成分、靶基因，本研究采用网络药理学方法，通过TCMSP数据库[TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)为公开的中药系统药理学数据库与分析平台]筛选寒喘祖帕颗粒的活性成分及其靶基因，同时通过CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank (收集了多种疾病相关基因的数据库)等四大疾病数据库收集毛细支气管炎相关靶基因，收集寒喘祖帕颗粒-毛细支气管炎共同的潜在靶基因，构建寒喘祖帕颗粒药材-潜在活性成分-潜在靶基因网络，找出了寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎活性成分、靶基因，并采用生物信息学分析了靶基因的生物学功能。

网络药理学研究结果表明，寒喘祖帕颗粒中的活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、咖啡酸、茴脑和齐墩果酸等在网络中节点度比较大，意味着参与的生物功能多，其生物学重要性越强，是寒喘祖帕颗粒治疗毛细支气管炎的潜在成分。RSV感染气道上皮细胞后下调E-cadherin的表达，致紧密连接相关蛋白易位，导致气道黏膜屏障功能受损。最新研究[14]报道证明，VEGFR磷酸化和TGF-β1是导致E-cadherin介质的屏障功能受损的重要因素。其中TGF-β1是诱导上皮细胞向间充质细胞转分化过程的关键靶基因[15]。研究[16]证明，山奈酚抑制TGF-β1mRNA 的表达，槲皮素抑制 TGF-β1诱导下A549细胞 E-cadherin的表达[17]，木犀草素对肝纤维化进程中TGF-β1诱导的肝细胞上皮间质转化有抑制作用[18]。而VEGF是表皮生长因子受体，可参与上皮细胞的生长、修复和瘤变，在黏蛋白的分泌、细胞间紧密连接的调控中起重要作用[19～20]。最新研究[14]报道，RSV感染气道上皮细胞可活化VGFR，下调气道上皮细胞紧密连接相关蛋白E-cadherin的表达，从而破坏气道黏膜的屏障功能。由此推测，寒喘祖帕颗粒的潜在成分主要阻止RSV与气道上皮细胞的E-cadherin结合，从而在毛细支气管炎治疗中发挥关键作用。

毛细支气管炎与哮喘免疫学发病机制相似，主要是细胞因子的变化，即细胞因子趋化内皮细胞在肺部聚集使之激活并释放炎症介质和病毒蛋白损伤气道黏膜上皮，导致呼吸困难及喘憋[21]。研究[22]报道，血清中可溶性IL-2受体升高，使T细胞和NK细胞活性受阻，对RSV的清除能力降低。由此推测，寒喘祖帕颗粒可能通过IL-2对毛细支气管炎症反应过程产生影响。

NF-κB信号通路和MAPK参与气道上皮细胞高分泌与炎症反应。Toll 样受体信号通路与RSV诱导气道炎症相关[23]。JAK/STAT信号通路和FoxO信号通路调控气道黏蛋白高分泌[24～25]。NOD 样受体信号通路和TNF信号通路与毛细支气管炎气道炎症反应的发生有关[26]。研究发现，TLR4/NF-κB信号通路的激活在气道上皮细胞炎症反应中发挥重要作用，而槲皮素可以通过下调气道上皮 TLR4/NF-κB 表达，减轻气道的炎症反应。β-谷甾醇能够抑制炎症因子TNF-α和IL-6的表达，且可以下调NF-κB信号通路的活化[27]。本研究结果表明，以上的NF-κB、MAPK、JAK/STAT、FoxO、TNF和NOD 样受体信号通路均符合FDR≤0.01，这与前期报道相符合。

综上所述，寒喘祖帕颗粒9味药材共收集到14个活性成分β-谷甾醇、槲皮素等及197个活性成分靶基因，寒喘祖帕颗粒-毛细支气管炎共有的潜在靶基因50个。药物疾病共有潜在靶基因主要参与炎症反应、免疫反应、凋亡过程等生物学功能，主要信号通路有JAK/STAT信号通路、NOD 样受体信号通路和TNF信号通路等。寒喘祖帕颗粒的槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、咖啡酸、茴脑和齐墩果酸等活性成分可能作用于TGF-β1、VGFR、TNF-β、IL-6、IL-2，抑制气道黏膜上皮细胞屏障和肺内炎症介质的释放而发挥治疗毛细支气管炎的作用，但其具体的药理作用仍需要通过临床实验进行验证。