云南省东川区马铃薯地方特色品种“开花洋芋”鉴定

朱曦鉴， 易 靖， 梁静思， 朱维贤， 李灿辉， 唐 唯

(1.云南师范大学马铃薯科学研究院， 昆明 650500； 2.云南省昆明市农业科学研究院， 昆明 650201)

马铃薯(南方多边俗称洋芋)为外来农作物，在清代中期引入中国，云南最早在清道光年间有记载种植于昭通[1,2]。由于云南的地理气候条件类似于安第斯山脉的马铃薯起源地，几百年来，这些外来品种对云南的政治、经济和文化传播起到了深远的影响。云南省比较典型的地方品种有香格里拉地区的中甸红，丽江地区的老鼠洋芋，大理的剑川红和耗子洋芋，东川的“开花洋芋”，曲靖的转心乌，昭通的自来洋芋和红马栏，及文山的小紫洋芋[3,4]。其中“开花洋芋”常年种植于昆明市东川区李子沟高寒山区，因缺乏准确文字记载，具体引入年代已不可考证，但有东川年鉴记载“开花洋芋”自20世纪70年代从昆明市禄劝县转龙镇引进种植，当时称“老家洋芋”[5]。该品种皮红肉黄，蒸煮后像开花的花瓣，肉色金黄，口感酥松香醇，一直受到省内外马铃薯高端市场的欢迎，目前该品种已注册品牌。

由于休眠期短，“开花洋芋”仅种植于东川区李子沟高山峡谷地区，其独特的地理条件有利于农户种植和种薯保存，因此近百年来该品种资源得以保存下来。但是，该品种不能在更大地域范围内开发利用，薯型差且种薯在储藏期容易发芽和出现薯块黑斑，病毒病连年加重，退化较为严重，产量和抗病性均存在下降，进入省外市场常常受阻。除此之外，品种混淆问题也严重制约着“开花洋芋”的推广和大面积种植，且目前“开花”原因和遗传背景尚不清楚。据此，本研究以“开花洋芋”为材料，采用植物学和农艺性状观察，细胞质遗传特点和细胞核SSR多态性分析结合的方法，以东川区4个马铃薯主栽品种为对照，深入解析“开花洋芋”的种质资源特点，将对其生产、栽培管理和种质资源利用及保存都具有深远意义，也有助于地方特色品种的开发及边远山区的扶贫攻坚。

1 材料与方法

1.1 材 料

原产于东川的“开花洋芋”，组培苗于2017年由昆明市农科院提供。其它主栽品种大西洋、米拉、合作88和威芋3号为对照材料，组培苗由云南师范大学马铃薯科学研究院提供。

1.2 方 法

1.2.1植株性状的观察

原产地田间播种，待出苗整齐后，每隔10 d对株型，叶型，花型和花色进行实地观察记录及拍照。

1.2.2染色体组的倍性检测

四倍体马铃薯C 88为对照，样品制备参照施春晖等，流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性技术研究[6]。流式细胞仪FACSVerse(美国Becton Dinckinson公司)，按照仪器操作流程对“开花洋芋”染色体组倍性进行测定。

1.2.3细胞质DNA标记检测

马铃薯叶片总基因组的提取，利用植物基因组提取试剂盒(DP 320，Tiangen， 北京)，按说明书进行操作。提取的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，稀释到50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存。

利用4对马铃薯叶绿体DNA(cpDNA)多态性标记及2对马铃薯线粒体DNA(mtDNA)多态性标记对鉴定材料和对照材料进行PCR扩增检测，引物信息及扩增条件见表1，可将待测马铃薯细胞质划分成T型(四倍体普通栽培型S.tuberosumssp.tuberosum)、W型(野生型)、D型(来源于六倍体S.demissum的野生马铃薯类群)、A型(安第斯栽培类型S.tuberosumssp.andigena)。

PCR扩增体系为：模板DNA 50 ng，10×Taq buffer 2.5μL，正反向引物各10μM，dNTPs (2.5 mM each)2.0μL，Taq DNA聚合酶(天根生物科技有限公司)2 U，补ddH2O至终体积25μL。按照引物原文献条件设置PCR程序。PCR后用130 V，400 mA，2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，记录各带型。

表1 引物信息

引物名称退火温度/℃扩增位点标记类型T[7]60ndhC/trnVSCARS[8]60rps16/trnQSSRSAC[9]601/11aCAPS(BamHI)D[10]60Band1SCARA[8]6010CAPS(BamHI)ALM4/5[11]57cob,rps10SCAR

注：表中T、S、A和SAC为叶绿体标记；D和ALM 4/5为线粒体标记，引物序列参照原文献。

1.2.4细胞核SSR标记检测

利用中华人民共和国国家标准GB/T 28660-2012《马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记》所列的12对核基因组SSR引物(表2)，对待鉴定样品和对照样品进行PCR扩增及荧光标记毛细管电泳检测，扩增条件参照GB/T 28660-2012，毛细管电泳检测参照唐唯等[12]的方法进行。

表2 所用SSR引物的信息

注：引物序列参照GB/T28660-2012 (马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记)。

将12对SSR引物的所有片段分子量从小到大排列，按照引物顺序，鉴定材料和对照品种逐个对多态性条带进行统计，在相同位置，有条带的记为1，无条带的记为0，组成1和0的矩阵表，此即为品种的DNA指纹图谱。采用Nei和Li提出的统计方法计算遗传相似系数(GS)：GS=2 Nij/(Ni+Nj)，其中Ni为第i个品种的扩增条带数目，Nj为第j个品种的扩增片段数目，Nij为第ij个品种间共有的带谱数目。用MVSP Ver 3.1软件以GS值，非加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类，绘制树状图。

2 结果与分析

2.1 植物学特征与农艺性状的观察

原产地调查结果发现，“开花洋芋”仅在东川区李子沟几个自然村种植。李子沟平均海拔2 600 m，为高山峡谷地貌，昼夜温差大(图1 a)。

注：a为生长环境；b为叶形；c为花色；d为薯形；e为蒸煮后状态。

植物学特征：“开花洋芋”生长周期较长，田间植株高大直立，生长旺盛；复叶较小，小叶分布紧凑，顶叶较小，叶片皱缩，复叶与茎杆着生成锐角、半直立生长；开花繁茂，星状花冠，花紫色或紫红色，花药小而整齐，花梗直立。具有野生种的形态特征(图1 b，图1 c)。

农艺学性状：薯块顶芽凹陷，芽眼深，薯型为球形或者扁球形，红皮黄肉，蒸煮后表皮开裂脱落类似开花状，薯块休眠期短，蒸煮品质佳、淀粉颗粒大，口感酥、洋芋风味浓(图1 d，图1 e)。

2.2 马铃薯线粒体和叶绿体基因组分子标记检测

利用6对马铃薯细胞质基因组标记对待测马铃薯DNA进行PCR扩增，结果发现“开花洋芋”样本的细胞质类型为W/α[D]型。W/α细胞质类型主要来自野生种，D型细胞质类型则仅为六倍体马铃薯野生种(S.demissum)及其祖先二倍体野生种(S.verrecosum)所有。对照材料大西洋、米拉和威芋3号的细胞质类型均为T/β，是四倍体普通栽培种典型的细胞质类型；对照合作88细胞质类型为W/α[D]，是公认的具有野生种血缘的安第斯栽培类型品种。

注：a为S标记；b为T标记；c为D标记；d为AML 4/5标记；e为SAC标记；f为A标记；K为“开花洋芋”WY-3(威芋3号)；M为米拉C 88(合作88 DXY:大西洋)。

2.3 染色体组倍性检测结果

以已知四倍体C 88染色体为对照的倍性检测结果发现，“开花洋芋”染色体为四倍体(图3 b)。

注：a为C 88；b为“开花洋芋”。

2.4 细胞核基因组的SSR标记检测和聚类分析结果

对“开花洋芋”马铃薯样本和4个对照材料，依次将STM 0019 a、STM 0030、STM 0037、STM 1049、STM 1053、STM 1104、STM 1106、STM 2013、STM 2022、STM 3012、STM 3032 a、STpoAc 58引物扩增的所有片段从小到大排列，各位点存在的片段用1表示，不存在的片段用0表示，建立了5个品种的DNA 分子指纹库图谱(表3)。

表3 细胞核基因组DNA分子指纹图谱

品种DNA指纹图谱开花洋芋000010001001101001010111001101010101101010111110111大西洋000010100100111100111011011011110000111011001000100米拉101110001011001001111111111011011001101110111100011威芋3号011011001001101000011011001011110000101011011010111合作88001010010001101010111111001111110011101010011001110

利用MVSP Ver 3.1软件进行UPGMA聚类分析，对送检“开花洋芋”马铃薯样本和4个对照材料SSR扩增片段进行亲缘关系分析发现，在遗传相似性系数为0.742时，可以把5个品种完全分开，“开花洋芋”和米拉亲缘关系最近，与大西洋亲缘关系最远(图4，表4)。

图4 12对引物对5个马铃薯品种的聚类分析

表4 “开花洋芋”和4个主栽品种亲缘关系分析

品种遗传相似性系数大西洋米拉威芋3号合作88开花洋芋0.5380.7410.7330.714

利用12对SSR引物对“开花洋芋”、大西洋、米拉、威芋3号、合作88的多态性的检测获得了“开花洋芋”的分子指纹图谱。聚类分析结果(表4)表明，“开花洋芋”与对照主栽品种的遗传相似性系数均较低，为明显不同的品种资源。

3 讨 论

在分子标记技术广泛用于种质资源鉴定前，马铃薯品种鉴定主要通过其形态学特征和农艺性状指标进行，该方法可较为准确的把不同品种区分开来，但该方法容易受到环境条件和个体生长发育阶段的影响，具有不确定性。因此，本研究首先利用细胞质基因组DNA多态性标记进行鉴定。由于胞质细胞器具有母系遗传的特点，因此可认为即使是在杂交多代后，仍然可用于追述植物母本的最佳手段[9]。本研究利用6个细胞质DNA多态性标记，确定“开花洋芋”是具有W/α[D]型细胞质的野生型品种。W型为1922—1925年由德国选育，1948年美国人利用W型材料育出了著名品种康奈拜克。据此，具有野生型血缘关系的品种“开花洋芋”品种，应该也存在了近百年。有研究报道称，蒸煮“开花”、薯块颜色鲜艳、休眠期短等特色农艺性状为二倍体种(S.phureja)特有[13-14]，S.phureja常用作改善优良性状的杂交亲本材料外，还能孤雌生殖诱发四倍体栽培种产生双单倍体[15]。本实验中有2个证据不支持“开花洋芋”和S.phureja有明显血缘关系，第一是染色体倍性，“开花洋芋”为四倍体而S.phureja为二倍体；第二是线粒体多态性标记，“开花洋芋”为D型而S.phureja为P型。D型均为含有(S.demissum)六倍体野生种细胞质基因组的野生型栽培品种。S.demissum起源于墨西哥，20世纪20年代开始引入德国作为育种材料引入到四倍体栽培种中，在前人的研究中发现，云南省西北部一些地方品种中含有此细胞质多态类型，例如木嘎洋芋，老鼠洋芋和大湾洋芋[2]。Lossl A等[16]和Ducreux L J M等[17]研究表明，具有α类型线粒体多倍型的薯块中淀粉含量较高，因此在蒸煮中容易“开花”。本研究已证实东川“开花洋芋”为四倍体型，但倍性和蒸煮开花之间的关系有待进一步解析。

为了避免在形态学和农艺学性状观察上的误差，在确定细胞质多态性类型的前提下，本研究进一步在细胞核水平，利用马铃薯种薯鉴定国家标准中所用的12对SSR标记对“开花洋芋”和东川区其它几个有代表性的主栽品种进行了遗传结构分析并建立了DNA分子指纹，结果表明，“开花洋芋”在DNA水平上是显著不同于其它几个品种，在已发表的关于云南省地方马铃薯的DNA指纹库的文献中，也没有发现有相同的品种[18]。

因此，基于细胞质多态性特点、细胞核遗传分析、蒸煮风味和“开花”特性认为，“开花洋芋”是1个典型的马铃薯地方特色品种。本研究可为“开花洋芋”种质资源保护利用、地方品种种质资源鉴定以及分子标记辅助设计育种提供理论支持。