食用菌对香肠发酵菌降解亚硝酸盐的影响

刘宇涵，于佳楠，马金凤，何 玲，陶 硕，范文博，丁玉萍，2

（1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154002；2.中-乌农林技术开发与应用国际合作联合实验室，黑龙江佳木斯 154007）

发酵香肠最早出现在地中海地区，随着经济、技术和工业的进步，人们生活水平的提高和健康意识的提高，发酵香肠产品的开发和发展备受关注[1]。最初的自然发酵，是富集在环境中的天然微生物，产品品质很难保证[2-3]。如今，多采用现代生物技术和控制发酵条件，人工添加发酵剂与自然发酵相比，现代发酵香肠在营养、风味、稳定性等方面都得到了提高。传统香肠通常添加亚硝酸盐，亚硝酸盐除了可作为肉的保护剂、改善肉的颜色以外，还能改善肉类风味，对肉毒杆菌也有特殊的抑制作用，起到防腐剂的效果，是国家列入允许使用的食品添加剂之一[4-8]。但已有研究表明，亚硝酸盐与肉制品中的胺在一定条件下会生成亚硝胺，有潜在的致癌作用，影响人体健康，所以国家对亚硝酸盐的使用量有严格规定，亚硝酸盐残留问题一直被世界卫生组织所关注[9-12]。

近年来，市场上食用菌生产量高、品种多样、价格便宜、口感独特，如杏鲍菇具有愉悦的杏仁香味和鲍鱼口感，质地脆嫩、肉质肥厚、口感鲜嫩、味道清香[13-14]。香肠中加入食用菌，不仅口感可以得到改善，而且对人体健康有益。现代研究表明，食用菌中所含的多糖、维P、氨基酸和麦角固醇等营养物质，能增强机体的抗病能力，提高机体抑制肿瘤的能力，具有镇静血压、降低胆固醇、预防动脉硬化等功能[15-22]。目前，可查到的相关文献，多数为益生菌降低亚硝酸盐的研究。例如，Li Pei Jun等人[23]向生肉糜中加入木糖葡萄球菌和戊糖片球菌，发现它们有将高铁肌红蛋白转换为亚硝基肌红蛋白的能力，从而可以减少亚硝酸盐的含量。崔珏等人[24]从酸菜中筛选降解亚硝酸盐能力强且适用于肉制品发酵的乳酸菌-鼠李糖乳杆菌，以筛选的菌株为发酵剂制作单菌株发酵香肠，通过检测证明，鼠李糖乳杆菌能有效降低发酵香肠中的NaNO2含量。在香肠中添加食用菌的研究也有报导，段善海等人[25]研究在香肠中添加一定量的鸡腿菇，可使香肠具有独特的风味和良好的营养保健作用。探究食用菌对益生菌降解亚硝酸盐的影响尚未见报导。研究是在混合益生菌发酵香肠中添加食用菌，以益生菌对亚硝酸盐的降解率为评价指标，利用单因素试验和正交试验方法，探究平菇、杏鲍菇、金针菇、香菇4种食用菌单一添加或混合添加对香肠发酵菌降解亚硝酸盐的影响，旨在为添加食用菌的益生菌发酵香肠的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

金针菇、平菇、杏鲍菇、香菇、食盐、黄豆、奶粉，购自佳木斯超市；食品级亚硝酸盐，购自食品添加剂商店。

1.1.2 菌种

益生菌菌种（嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌），佳木斯大学发酵工程实验室提供。

1.1.3 培养基

模拟培养基（1 kg）：奶粉20 g，蔗糖30 g，亚硝酸盐150 mg，食盐15 g，折光度5%豆浆定量至1 kg，于115℃下灭菌15 min。

活化培养基（1 L）：奶粉20 g，蔗糖30 g，用折光度5%豆浆定容至1 L，于121℃下灭菌15 min。

1.1.4 化学试剂

盐酸纳乙二胺（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂提供；亚铁氰化钾（分析纯），哈尔滨市新达化工厂提供；硼砂（分析纯），天津市瑞金特化学品有限公司提供；亚硝酸盐（分析纯），北京奥博星生物技术有限责任公司提供；对氨基苯磺酸（分析纯），哈尔滨化工化学试剂厂提供；乙酸锌（分析纯），天津市凯通化学试剂有限公司提供；冰乙酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；盐酸（分析纯），新海乳溶厂提供。

1.2 试验仪器

SPX-250B-Z型生化培养箱、YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；UV754型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；JYD-D02V/D57型组织破碎机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；SpectrumLab22PC型超声波清洗器，上海棱光技术有限公司产品；HH-Z2型恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司产品；PHS-2C型数显酸度计，杭州雷磁分析仪器厂；标准型净化工作台，上海跃进医疗器械厂产品；AB104-S型电子天平，METTLER TOLEDO Made in Switzerland产品。

1.3 试验方法

1.3.1 混合益生菌菌种的活化

将保存的益生菌菌种按1∶1∶1∶1比例接入活化培养基中，于37℃条件下培养24 h，取出备用。

1.3.2 食用菌处理

食用菌清洗后，用组织破碎机破碎，按比例添加至模拟培养基中。

1.3.3 接种

按6%的接种量接入活化后的混合益生菌菌种。

1.3.4 发酵

将接种后的模拟培养基于37℃培养箱中培养，24 h后取出，测定亚硝酸盐含量，计算降解率。

1.3.5 亚硝酸盐残留量测定

参照GB 5009.33—2016中分光光度法测定样品中亚硝酸盐含量。

亚硝酸盐标准曲线见图1。

图1 亚硝酸盐标准曲线

1.3.6 亚硝酸盐含量的降解率

式中：P——亚硝酸盐的降解率，%；

X1——试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

100.93 ——加入150 mg/kg食品级亚硝酸盐的模拟培养基未发酵前测得亚硝酸盐的含量，mg/kg。

1.3.7 单因素试验设计

对平菇、杏鲍菇、香菇、金针菇4种食用菌的添加量进行单因素试验，4种食用菌添加量的梯度设置均为0，20，40，60，80 g/kg。按6%的接种量接入活化后混合益生菌菌种，于37℃下培养24 h，取出测亚硝酸盐含量及pH值。各组做3个重复，结果取平均值。

1.3.8 正交试验设计

为了探究4种食用菌同时添加对降低亚硝酸盐的影响，以平菇、杏鲍菇、香菇、金针菇为考查因素，利用四因素三水平L9（34）正交试验表进行试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计/g·kg-1

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 平菇对降低亚硝酸盐的影响平菇单因素试验结果见图2。

图2 平菇单因素试验结果

由图2可知，添加平菇的亚硝酸盐降解率均比未添加平菇的高。用量从2 g/kg至80 g/kg亚硝酸盐降解率呈正态分布。未添加平菇的亚硝酸盐降解率为83.27%；用量为60 g/kg降解率最高为96.36%，比未添加平菇降解率高6.94%，同时平菇用量为60 g/kg时，pH值为3.26是5组中最低的，添加平菇组的pH值均比未添加平菇组的低。

2.1.2 杏鲍菇对降低亚硝酸盐的影响

杏鲍菇单因素试验结果见图3。

由图3可知，添加杏鲍菇的亚硝酸盐降解率均比未添加杏鲍菇的高。用量从20 g/kg至80 g/kg压硝酸盐降解率呈正态分布，最高值比最低值高3.47%，差异不显著；未添加杏鲍菇的亚硝酸盐降解率为83.27%；用量为40 g/kg降解率最高为93.88%，比未添加杏鲍菇降解率高10.61%。亚硝酸盐降解率最高组pH值最低，之后随着杏鲍菇量的增加，pH值有所升高。

图3 杏鲍菇单因素试验结果

2.1.3 香菇对降低亚硝酸盐的影响

香菇单因素试验结果见图4。

图4 香菇单因素试验结果

由图4可知，香菇用量从20 g/kg至80 g/kg亚硝酸盐降解率呈正态分布，均比未添加香菇的高；未添加香菇的亚硝酸盐降解率为83.27%；香菇用量40 g/kg时降解率最高为93.72%，比未添加香菇降解率高10.45%。同时添加香菇的pH值均比未添加香菇的低，用量为40 g/kg组，pH值最低3.17。

2.1.4 金针菇对降低亚硝酸盐的影响

金针菇单因素试验结果见图5。

图5 金针菇单因素试验结果

由图5可知，添加金针菇组亚硝酸盐降解率均高于未添加金针菇组。用量从20 g/kg至80 g/kg亚硝酸盐降解率呈正态分布；未添加金针菇的亚硝酸盐降解率为83.27%；用量为60 g/kg降解率最高为95.69%，比未添加金针菇降解率高12.42%。同时金针菇用量为60 g/kg时，pH值为3.15是5组中最低的，添加金针菇的pH值均比未添加金针菇的低。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果与分析

按6%的接种量接入活化后的混合益生菌菌种，于37℃条件下培养24 h，取出测亚硝酸盐，计算降解率。

正交试验结果与数据分析见表2。

表2 正交试验结果与数据分析

由表 2 可知，RC＞RB＞RA＞RD，4 种食用菌对香肠发酵菌降解亚硝酸盐的影响均具有促进作用，影响从大到小依次为金针菇＞杏鲍菇＞平菇＞香菇。A因素列：K2＞K1＞K3，B 因素列：K3＞K2＞K1，C 因素列：K2＞K3＞K1，D 因素列：K2＞K3＞K1。由此可以得出正交试验优化的组合为A2B3C2D2，即平菇20 g/kg，杏鲍菇30 g/kg，金针菇用量20 g/kg，香菇用量20 g/kg。最好组为2号组合A1B2C2D2（Z1）和4号组合A2B1C2D3（Z2），降解率相同，均为98.12%。

2.2.2 对比验证试验

对正交试验得出较好的3个组合，即Y（A2B3C2D2），Z1（A1B2C2D2），Z2（A2B1C2D3），做对比验证试验，计算降解率。

混合食用菌对香肠发酵菌降解亚硝酸盐影响见图5。

图5 混合食用菌对香肠发酵菌降解亚硝酸盐影响

由图5可知，比较3组的降解率最高组Z1为98.36%；其次为Y组为98.04%，比Z1组低0.32%；最低的是Z2组为97.87%，比最高组低0.49%。因此，正交试验优化的最佳组合为Z1组，即4种食用菌的用量分别为平菇10 g/kg，杏鲍菇20 g/kg，金针菇20 g/kg，香菇20 g/kg。

3 结论

通过单因素试验得出，4种食用菌单独添加时各用量为平菇60 g/kg，杏鲍菇40 g/kg，香菇40 g/kg，金针菇60 g/kg，此时食用菌对香肠发酵菌降解亚硝酸盐影响最好，降解率高。单因素试验结果表明，添加食用菌组亚硝酸盐降解率均比未添加食用菌组高；添加食用菌组的pH值均比未添加食用菌组低。降解率最高组，pH值最低，说明添加食用菌能促进香肠发酵益生菌的代谢，产酸量多，并促进亚硝酸盐的分解，提高降解率。

利用正交试验对4种食用菌进行组合试验得出，4种食用菌组合用量分别为平菇10 g/kg，杏鲍菇20 g/kg，金针菇20 g/kg，香菇20 g/kg时，香肠发酵菌降解亚硝酸盐的效果最好，降解率为98.36%。通过比较单因素试验和正交试验结果，添加总量相近时，4种食用菌混合添加比单独添加一种食用菌促进益生菌降低亚硝酸盐降解效果好。使用的混合益生菌是由嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌所组成，均属于乳酸菌，而乳酸菌本身合成核酸和氨基酸的能力较弱，生长和代谢需要特殊营养物质。