伏核神经元ERK1/2 在GalR1 激活对神经痛大鼠镇痛作用中的机制

李梦楠，徐焕焕，刘亚南，杨 双，李崇阳，徐世莲

（1） 昆明医科大学基础医学院生理学系，云南昆明 650500；2） 昆明医科大学第四附属医院肿瘤科，云南 昆明 650021）

神经病理性疼痛是临床常见的慢性疼痛，但由于其产生机制的复杂性和多样性，现有治疗药物或手段的疗效并不理想，且具有严重的副作用。因此研究神经病理性痛的潜在机制和治疗靶点，寻找新的毒副作用小的治疗药物迫在眉睫。

甘丙肽广泛分布于人类和哺乳动物的中枢神经系统和外周，是1983 年由Tatemoto 等[1]从猪的小肠分离提取出的一种含有29 个氨基酸（人：30个） 的重要的神经肽。甘丙肽具有多种生物学功能，且甘丙肽的作用是通过激活其受体完成的。目前已经克隆出三种甘丙肽受体（galanin receptor，GalR）：GalR1、GalR2、GalR3[2]。近年来，越来越多的研究报道甘丙肽通过激活其受体在痛觉的产生和调制中具有重要作用[3-7]，但有关甘丙肽激活其受体后调节痛觉信息的细胞信号转导机制目前尚研究较少。

细胞外信号调节激酶 （extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2） 是一类广泛分布于哺乳动物细胞的丝/苏氨酸蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPK） 家族成员之一。研究报道脊髓背角与痛觉相关的神经元内ERK1/2 信号通路的激活可能与痛觉过敏的发生有关[8-10]，而伤害性刺激也能激活脑内的ERK1/2 信号分子[11]。这些结果提示ERK1/2 信号通路在痛觉或痛觉过敏的产生中具有重要作用。Hawes 等[12]报道GalR2 激活后通过引起PKC 的活化，再激活MAPK/ERK 信号分子而促进神经轴突的生长。本实验室最近的研究表明伏核内GalR1 激活后通过抑制PKA 信号分子对神经痛具有镇痛作用[13]。本实验研究大鼠伏核内GalR1 激活抑制PKA 后是否进一步引起ERK1/2 信号分子的活性改变来完成对神经痛的镇痛作用。

伏隔核（nucleus accumbens，NAc） 又称伏核，位于基底核与边缘系统交界处，在痛觉信息的调制中具有重要作用[14]。本实验室先前的研究表明，在大鼠的伏核内注射甘丙肽具有镇痛作用[3，7]。在坐骨神经结扎大鼠伏核内注射GalR1 的特异性激动剂M617 引起大鼠对伤害性热和压力刺激诱发的后爪缩爪潜伏期（hindpaw withdraw latencies，HWLs）延长[6]，表明伏核神经细胞的GalR1 激活对神经痛具有镇痛作用，且这一作用是通过抑制PKA 完成的[13]，但有关其下游信号分子ERK1/2 的作用机制目前尚不清楚。

二大队电焊工陈国相创造了日焊固定口16道的新纪录，合格率100%。一大队王学斌创造了直径219毫米管线活动日焊21道的优异成绩。有一次在北京市朝阳区80点至82点管线安装施工时，由于施工地点地势低洼，加上农民冬灌浇水，到处泥泞不堪，挖好的管沟也都积满了泥水，汽车无法通过，发电机、电焊机运不到施工现场。当时正值11月间，季节已入初冬。为了抢时间，使工程如期完成。大家都脱掉鞋袜，卷起裤腿，踏进寒冷刺骨的泥水，前拉后推，使发电机、电焊机就位，然后顶着寒风焊接管线，焊接一段移动一段。直到这一地段的管线焊接完毕，大家几乎都被冻僵了。

实验分为假手术组和坐骨神经结扎组，和假手术组（n=6） 比较，左侧坐骨神经结扎后第14 天（n=6；hot-plate test：Pleft＜0.001，Pright＜0.001，Randall Selitto test：Pleft＜0.001，Pright＜0.01） 和第28天（n=6；hot-plate test：Pleft＜0.05，Pright＜0.05；Randall Selitto test：Pleft＜0.001，Pright＜0.05） 大鼠双侧后爪对伤害性热刺激和压力刺激诱发的HWLs均缩短，但坐骨神经结扎后第7 天差异无统计学意义（n=6；hot-plate test：Pleft＞0.05，Pright＞0.05；Randall Selitto test：Pleft＞0.05，Pright＞0.05）。各组间差异采用单因素方差分析比较，见图1。

1 材料与方法

1.1 材料

实验数据用“Mean±SEM”表示，使用Prism5统计软件进行分析，组间差异采用双因素方差分析（Two-way analysis of variance） 或单因素方差分析（One-way analysis of variance） 进行组间比较。检验标准为α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3.完善战略资源与人才激励机制。战略资源的合理应用对企业战略管理的成功实施至关重要，企业的战略资源包括人力资源、财力资源、物力资源、信息技术资源和科技创新等各种资源，任何一项战略资源的缺失都会影响到企业创新绩效管理的成功运行。因此，企业必须为自身的健康长远发展提供充足的物资支持。虎豹集团可以进一步加大高新技术研发、高层次人才引进以及营销渠道的拓展等。

叶圣陶先生说过，语文教材无非是例子。因此，教师要由“教教材”转变为“用教材教”。为了贯彻PISA理念，教师在教学中除了要改进阅读教学策略外，还要设计具有实用性和开放性的阅读题目。也就是说，语文阅读教学不是单纯教学生一篇课文，而是要在“访问和检索信息、整合和解释文本、反思和评价文本”中对学生进行思维训练。因此，教师设计的阅读教学问题应呈现开放或半开放特点。例如，在教授北京版语文八年级上册第14课《北京城的中轴线》时，教师会补充《内九外七皇城四》等材料帮助学生理解课文内容，并设计了如下问题。

1.2 手术和方法

观察组：品管圈护理。包括组建品管圈以及划分工作职能、制定品管圈活动步骤等，通过合理的工作责任划分，优化人员、工作安排，提高护理服务质量。

实验前，为了使动物对伤害性刺激的HWLs较为平稳，所有实验大鼠均需进行5 d 的训练，以使HWLs 保持在3～6 s。实验时，测量三次给药前的HWL，取平均值作为基础HWL，伏核内注射5，10，15，20，30，45 和60 min 后分别测量HWL，将给药后不同时间点的缩爪潜伏期换算成变化百分率，即：（给药后的HWL-基础HWL）/基础HWL×100%。

1.2.2 神经病理性痛动物模型的建立 采用坐骨神经部分结扎制作神经病理性痛动物模型[15]。大鼠随机分为坐骨神经结扎组和假手术组，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg） 麻醉。坐骨神经结扎组在左侧大腿中部暴露坐骨神经约1 cm，用4 号羊肠线结扎神经，共结扎四圈，每圈之间间隔约1mm。神经结扎后7～10 d 发生痛觉过敏，14～28 d 痛敏达到高峰[15]。

1.2.1 后爪缩爪潜伏期的测定方法 使用热板智能仪（Hot plate，YLS-6B，中国） 测定大鼠对伤害性热刺激诱发的HWL，热板温度保持在（52±0.2） ℃的范围内。使用Randall-Selitto（UGO Basile，37215，意大利） 测定大鼠对伤害性压力刺激诱发的HWL。

3.加强管理创新、营造良好的科研氛围。激发科技人员的积极性和创造性，完善科研考核奖励办法，完善技术创新机制，加大科技奖励力度，增强创新动力。

1.2.3 伏核埋管及微量注射方法 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg） 麻醉后，置于大鼠脑立体定向仪上。将外径为0.8 mm 的不锈钢套管垂直插入伏核（B，+1.7 mm；L or R，1.6 mm；V，7.0 mm），使用牙科水泥将套管牢牢固定。

大鼠手术后恢复2 d 以上，实验时，将外径为0.4 mm 的不锈钢管作为注射管，其尖端伸出埋置的套管约1～1.5 mm，以1 μL/min 的速度均匀将1 μL 的药物推入伏核中，药物推注完毕后注射管保持在注射部位停留1 min 以上，以使药物充分到达伏核内。

1.2.4 蛋白质印迹法 用4%异氟醚麻醉大鼠并断头取脑，快速取伏核组织。Westernblot 法检测总ERK1/2（total-ERK1/2，t-ERK1/2，1:1000，rabbit polyclonal，Abcam，USA），磷酸化ERK1/2（phospho-ERK1/2，p-ERK1/2，1:1000，mouse monoclonal，Abcam，USA） 的表达，并且以β-actin（mouse monoclonal，1:2 000，Santa Cruz） 为内参作为对照，用ImageJ 软件分析条带，表达结果重复三次以上。

1.1.2 实验药品 M617[galanin（1-13） -Gln（14）-bradykinin（2-9） -amid，Sigmia，美 国]；M35[galanin（1-13） -bradykinin（2-9） -amide，Sigma，美国）；SCH772984（AbMole，中国]。

1.3 统计学处理

1.1.1 实验动物 选用SD 雄性大鼠58 只（170～200 g，由昆明医科大学实验动物学部提供）。实验期间大鼠分笼饲养、自由进食和饮水，室温保持在22℃左右，自然光照。实验过程中最大限度地减少动物的痛苦，所有操作均符合昆明医科大学伦理委员会和国际疼痛协会的规定。

假手术组同样暴露坐骨神经，但不做神经结扎。两组大鼠右侧肢体均不做处理。大鼠术后恢复5 d，皮肤切口愈合，无感染后开始进行伏核埋管。

2 结果

2.1 左侧坐骨神经结扎引起大鼠HWL 缩短

在先前的研究基础上，本实验在坐骨神经结扎大鼠研究伏核神经元ERK1/2 在GalR1 激活对神经痛的镇痛作用中的机制，为临床治疗神经痛的药物靶点的研究提供实验依据。

2.2 左侧坐骨神经结扎引起大鼠p-ERK 的表达上调

行为学测试后，快速断头取伏核组织，Westernblot 法检测左侧坐骨神经结扎对p-ERK 表达的影响。和假手术组（n=3） 比较，左侧坐骨神经结扎后第28 天（n=3；P＜0.01） p-ERK1/2 的表达上调，但在结扎后第7 天（n=3；P＞0.05）和第14 天（n=3；P＞0.05）差异无显著性。组间差异采用单因素方差分析比较。提示伏核中的ERK1/2 信号分子在神经痛的调节中具有重要作用，见图2。

图1 左侧坐骨神经结扎对大鼠HWLs 的影响Fig.1 Effects of left sciatic nerve ligation on HWL in rats

图2 坐骨神经结扎对大鼠伏核神经元p-ERK1/2 表达的影响Fig.2 The expression of p-ERK1/2 in the NAc after left sciatic nerve ligation in rats

2.3 神经病理性痛大鼠伏核内注射M617 和M35对p-ERK 表达的影响

本实验室先前的实验表明在坐骨神经结扎大鼠伏核内注射M617 引起大鼠双侧HWLs 延长，而M35 能拮抗M617 的作用[6]。本实验在坐骨神经结扎后第28 天，大鼠伏核内分别注射1 μL 生理盐水、1 nmol 的M617 和1 nmol 的M35，注射15 min后断头取伏核组织，Westernblot 法检查p-ERK 的表达。与生理盐水组（n=3） 相比，伏核内注射M617 引起p-ERK 的表达下调（n=3；P＜0.05），但伏核内注射M35 无明显差异（n=3；P＞0.05），如图3 所示，组间差异采用单因素方差分析比较。提示GalR1 激活对神经痛的镇痛作用可能是通过抑制ERK1/2 信号分子来完成的。

图3 神经痛大鼠伏核内注射M617 和M35 对p-ERK1/2表达的影响Fig.3 Effects of intra-NAc administration of M617 and M35 on the expression of p-ERK1/2 in NAc of rats with neuropathic pain

2.4 神经病理性痛大鼠伏核内注射ERK 抑制剂SCH772984 减弱M617 的镇痛作用

为了进一步研究ERK1/2 信号分子在GalR1 激活引起的镇痛作用中的机制，本实验于坐骨神经神经结扎后第28 天，大鼠伏核内注射1 nmol 的M617，5 min 后分别向伏核内注射1，3，6 μg/μL的ERK 抑制剂SCH772984 或5%DMSO 作为对照组（n=7）。与DMSO 对照组相比，伏核内注射3 μg（n=8；hot-plate test：Pleft＜0.01，Pright＞0.05；Randall Selitto test：Pleft＜0.05，Pright＞0.05） 和6 μg（n=8；hot-plate test：Pleft＜0.01，Pright＜0.01；Randall Selitto test：Pleft＜0.01，Pright＜0.01） 的SCH772984 减弱M617 引起的HWLs 的延长；但注射1 μg 的SCH772984 差异无统计学意义（n=7；hot-plate test：Pleft＞0.05，Pright＞0.05；Randall Selitto test：Pleft＞0.05，Pright＞0.05）。如图4 所示，差异采用双因素方差分析方法比较。该实验结果进一步提示ERK 信号分子在M617 对神经痛的镇痛作用中具有重要作用。

3 讨论

目前治疗神经痛的药物主要包括阿片类镇痛剂、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA） 受体阻断剂、钠离子通道阻断剂等。这些药物对某些病人能产生短时的镇痛作用，但其副作用也是十分明显的，如镇静、恶心、腹泻、眩晕以及阿片类镇痛剂长期应用可发生耐受、心理/生理依赖、戒断综合征和自身觅药行为，因而大大限制了它们的应用。寻找持续有效且具有临床应用前景的治疗手段或药物，阐明其作用机制，已成为目前亟待解决的问题。

图4 神经痛大鼠伏核内注射SCH772984 对M617 引起的镇痛作用的影响Fig.4 Effects of intra-NAc injection of SCH772984 on M617-induced antinociception in rats with neuropathic pain HWL:hindpaw withdrawal latency

研究表明，甘丙肽在脑内对痛觉信息的产生和发展具有抑制作用[4，16]。本实验室前期的研究也表明，正常大鼠和炎症痛大鼠伏核内微量注射甘丙肽都具有镇痛作用，且甘丙肽的镇痛作用是通过激活其受体来完成的[3，7]。

三种GalR 都是G 蛋白耦联受体[17]。M617 是GalR1 的特异性激动剂[18]。有研究报道在正常大鼠脑室内[19]或中央杏仁核内[20]注射M617 具有镇痛作用。前期的研究也表明坐骨神经结扎大鼠伏核内注射M617 具有镇痛作用[6]，这些研究结果提示脑内GalR1 的激活具有镇痛作用。本实验室最近的研究表明伏核神经细胞的GalR1 激活后通过抑制PKA 信号分子对神经痛具有镇痛作用[13]，但有关PKA 被抑制后的下游信号分子ERK 在GalR1 对神经痛的镇痛作用的机制尚不清楚。

如果今天看到一个老婆婆，坐在河边用铁杵磨针，无论小学生还是大学生，乡下人还是城里人，可能都会认为她智力不全或神经错乱。因为每个人都明白，把铁杵卖给收废品的人，然后到小商店，可以买回一大包针。而且前前后后，用不了一个小时的时间。

ERK 是MAPK 家族成员之一，参与了一系列生物学功能，在疼痛的产生和传递中也有重要作用。有研究报道伤害性刺激和神经损伤，如伤害性热、压力和机械刺激、坐骨神经结扎和足底切口等均能引起p-ERK 在前额叶皮质以及脊髓的表达上调[8-10]。此外，前额叶皮质微量注射MAPK 抑制剂U0126 抑制p-ERK1/2 的激活可减轻压力刺激所致的痛觉过敏[21]，提示ERK1/2 通路的激活在痛觉的产生中具有重要作用，抑制ERK 通路则能减低痛敏。本实验研究结果表明，左侧坐骨神经结扎后第28 天大鼠伏核神经元p-ERK1/2 的表达上调。而伏核内注射M617 引起伏核神经元p-ERK1/2 的表达下调；但是伏核内注射M35 后P-ERK1/2 的表达无明显变化。M35 是GalR1 和GalR2 的阻断剂，对GalR1 的作用强于GalR2[22]。有研究报道GalR2 激活后通过PKC 的活化可激活MAPK/ERK 通路而促进神经元轴突的生长[12]。本实验伏核内注射M35 阻断GalR1 后对p-ERK 表达的影响，可能被其同时阻断了GalR2 后引起p-ERK的表达减少而削弱。这些结果表明伏核神经元GalR1 激活对神经病理性痛大鼠的镇痛作用可能是通过抑制PKA 后，再抑制ERK1/2 的信号通路完成的。

如今，城市高层建筑越来越多，其沉降引起的变形问题是一个值得关注的重点。对变形监测资料进行处理，建立数学模型进行预测分析，不同的模型有各自优缺点，但在众多模型中，灰色模型在沉降预测中有着独到之处[4]。针对传统GM（1，1）模型预测精度不高的情况，本文利用残差值进行修正，建立了残差GM（1，1）预测模型。通过实例分析发现，改进后的残差模型相比传统GM（1，1）模型，精度上有了更大的提高，预测结果更贴近真实值。因此，建立残差灰色模型对于判断建筑物的沉降变形，预测其沉降趋势有一定的意义。

为了进一步证明PKA/ERK 信号通路在GalR1对神经痛镇痛作用中的作用，本实验在伏核注射M617，5 min 后注射ERK1/2 的特异性抑制剂SCH772984，结果发现SCH772984 能减弱M617 的镇痛作用，且呈剂量依赖性，进一步提示了神经病理性疼痛大鼠伏核神经元ERK1/2 信号分子活性的改变参与了GalR1 的镇痛作用。

总之，该研究表明坐骨神经结扎大鼠伏核神经元p-ERK 的表达上调；而伏核内注射M617 激活GalR1 后引起p-ERK 的表达下调；伏核内注射SCH772984 抑制了ERK 的活性则能削减M617 引起的镇痛作用，但伏核内注射M35 对p-ERK 的表达没有显著性影响。这些研究都提示在神经痛大鼠伏核，ERK1/2 在GalR1 激活引起的镇痛作用中具有重要作用，但GalR2 的激活对ERK 信号分子的影响也发挥着重要作用，有待进一步研究。