百岁老人肠道双歧杆菌分离鉴定研究

王少博，陈树兴，程晶晶，陈拾 ，茹元朴，刘风英，陈历俊

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023；2.洛阳市种子管理站，河南洛阳 471002；3.国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京 100163；4.北京市乳品工程技术研究中心，北京 100163）

0 引言

人体肠道作为人体微生物的主要栖息场所，是人类最为庞大和复杂的微生态系统。人体肠道的主要益生菌是一类对宿主起到有益作用的活性微生物，主要分为乳酸菌类、双歧杆菌类、酵母菌类、益生芽孢杆菌类、丁酸梭菌类等5 种[1]。双歧杆菌作为评价人体肠道的健康与否的重要标志物，在人类的长期进化中与宿主形成互惠共生的关系[2]。作为人体肠道的一种重要益生菌，双歧杆菌通过定植于机体肠道黏膜细胞，参与机体免疫、营养、消化和保护等一系列生理过程[3]，起到提高免疫力、调节肠道菌群结构、促进营养成分吸收等作用[4]。

人体的健康状况与肠道微生物的种类、多样性有着直接的关系，与益生菌的种类与数量呈正相关[5]。美国贝勒医学院Han B 等人[6]研究发现肠道微生物的单个基因与宿主寿命的关系，揭示肠道微生物与健康长寿的重要作用。Wang F 等人[7]研究长寿老人肠道双歧杆菌结构的关系，显示长寿老人肠道双歧杆菌更为复杂和多样，且数量显著增加，所以百岁老人的肠道双歧杆菌就更有分离和研究的价值。乌云等人[8]在分离新生儿肠道双歧杆菌时，利用莫匹罗星锂盐和X-Gal 的改良基础培养基快速分离双歧杆菌，并结合全自动微生物系统和API 20A 试剂条进行菌种鉴定。赵笑笑等人[9]利用改良的MRS 培养基的从婴儿粪便中分离到5 株双歧杆菌菌株，并通过16S rDNA 测序分别鉴定出在其菌种种类。X-Gal全称5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的显色底物，水解之后呈现蓝色。所有具有活性的β-半乳糖苷酶的微生物，都可以分解X-Gal，使其菌落周围呈现泛蓝的现象[10]。

对于使用X-Gal 分离与鉴定双歧杆菌菌株，已经有不少报道与研究。但是双歧杆菌作为严格厌氧菌，X-Gal 用于双歧杆菌的分离并不是该菌属的特异性指示剂，从粪便中分离较为困难，分离方法仍然不够细致具体。试验利用X-Gal 和莫匹罗星锂盐改良的双歧杆菌BS 培养基作为粪便分离培养基，采集百岁老人粪便样品，进行粪便样品采样液的筛选，结合16S rDNA 的菌种鉴定，总结出在粪便中利用X-Gal 分离双歧杆菌的过程中显色菌落的大致范围。以期为后续研究者在肠道双歧杆菌的分离与鉴定提供参考基础和方法支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粪便样品采集管，美国stratec 分子科技公司提供；双歧杆菌BS 培养基、莫匹罗星锂盐、L-半胱氨酸盐酸盐，青岛海博生物提供；X-Gal（-20 ℃），上海源叶生物公司提供；吐温80、甘油三酯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、甘油，均为分析纯，天津德恩化学试剂公司提供；API50CH 生化反应试剂条，法国生物梅里埃公司提供；16S rDNA 27F-1492R 通用PCR 扩增引物、4S GelRed 核酸染料、Taq PCR Master Mix（2x，blue dye）、DNA 分子量标准Marker F+（200～2000 bp），上海生工生物工程提供；E.Z.N.A.R soil 试剂盒，美国欧米伽生物科技公司提供；琼脂糖，美国Genview 科技公司提供；Tris-base，合肥Biosharp 生命科学公司提供。

CYS 缓冲液即L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液：L-半胱氨酸盐酸盐0.20 g，磷酸氢二钠2.40 g，磷酸二氢钾 1.80 g，吐温80 0.24 g，于400 mL 纯化水中，调节pH 值为6.8～7.0，灭菌条件121 ℃，15 min。

1.2 仪器与设备

超净无尘工作台，苏州净化（江苏）有限公司产品；DH-600 型生化培养箱，北京科伟永兴仪器公司产品；A05077 型厌氧培养罐，美国基因科学公司产品；ABI GeneAmp R 9700 型PCR 仪，美国应用生物系统公司产品；H1650 型台式高速离心机，苏州迅博科学仪器公司产品；DYY-6C 型稳压稳流型电泳仪，上海博通化学科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，美国伯乐BIO-RAD 公司产品；NanoDrop 2000 型紫外-可见分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 粪便样本的采集

在洛阳市民政局的帮助下，征集并筛选的共计6 组洛阳当地百岁老人志愿者（编号A、B、C...F），筛选条件为无重大疾病且1 月内无抗生素的摄入。使用无酶无菌且内装有3 种不同采样液的粪便样品管，采集老人的新鲜粪便作为样本，并选取了1 名1 周岁左右的婴儿新鲜粪便作为对照样本，样品采集后储存于冰盒内，并于2 h 内运送到实验室进行后续分离鉴定。

1.4 采样液的筛选

3 种采样液分别为双歧杆菌BS 培养基、25%甘油溶液和0.9%生理盐水溶液，选择CYS 缓冲液（L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液：L-半胱氨酸盐酸盐0.20 g，磷酸氢二钠 2.40 g，磷酸二氢钾 1.80 g，吐温80 0.24 g，于 400 mL 纯化水中，调 pH 值为 6.8～7.0，灭菌条件121 ℃，15 min）作为稀释液。

使用CYS 缓冲液作为样品稀释液[11]，涡旋振荡制成悬液，并用CYS 溶液稀释，将稀释液以倒平板方式接种于添加了X-Gal（终质量浓度0.06 g/L）和莫匹罗星锂盐（终质量浓度4 g/L）双歧杆菌BS 固体培养基中，按照国标方法GB 4789.35—2010[12]进行显色菌落总数计数，3 组重复试验取平均菌落总数计数（CFU/g），并比较结果。

1.5 粪便样品的处理、分离及筛选

使用双歧杆菌BS 培养基作为采样液的样品，涡旋振荡制成均匀悬液，然后依次用无菌CYS 缓冲液进行梯度稀释至1×10-6。选取其中适宜的几个稀释度的样品悬液1 mL 采用倒平板的方式接种于改良的双歧杆菌BS 培养基上，每个稀释度至少平行3 个平板。放入厌氧培养罐中，于37 ℃条件下恒温厌氧培养48 h 后，并进一步进行梯度稀释和划线纯化分离，获得镜检纯菌株。

1.6 镜检纯菌株的生化鉴定和有机酸代谢产物测定

酶试验时，挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，于0.5 min 内发生气泡者为阳性，不产气泡者为阴性[13]。

对过氧化氨酶试验呈阴性者进行纯培养，收集整个平皿上所有菌落制成浓菌悬液，按照API50CH 说明书接种试剂条。试剂条于37 ℃条件下厌氧培养48 h后判读结果。同时，用生理盐水稀释上述浓菌悬液至相当于0.5 麦氏浊度后，接种乳酸菌成套生化鉴定管，于37 ℃条件下需氧培养24～48 h 后判读结果[14]。

用灭菌竹签挑取纯菌株接种PYG 液体培养基，于37 ℃条件下厌氧培养48 h。根据国标GB 4789 34—2016[15]附录B 中规定处理菌液，制备乙酸和乳酸提取物，进行液相色谱测定。液相色谱条件：色谱柱，ZorbaxSb-Aq 液相色谱柱 （4.6×150 mm，5 μm）或其他等效色谱柱；流动相：20 mmol/L 的磷酸二氢钠溶液（pH 值2.0）-乙腈（99+1），等度洗脱，流速1 mL/min；柱温箱：35 ℃；紫外检测波长：210 nm；外标定量。计算有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比，比值大于1 即为双歧杆菌的代谢特性。

1.7 筛选菌株DNA 的PCR 扩增和电泳、16S rDNA菌种鉴定

根据 E.Z.N.A.R soil 试剂盒 （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA 抽提，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 进行检测，利用1%琼脂糖凝胶检测DNA 提取质量；用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TAC CTTGTTACGACTT-3')引物对16S 区进行PCR 扩增，扩增程序为：于94 ℃条件下预变性5 min，35 个循环（94 ℃变性 30 s，54 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1.5 min），最后于 72 ℃条件下延伸 10 min（PCR 仪：ABI GeneAmpR9700 型）。扩增体系为 25 μL，引物各 1 μL（27F-1492R），9.5 μL 超纯水，12.5 μL Taq PCR Master Mix （2x，blue）[16]。

根据 Illumina MiSeq 平台 （Illumina，San Diego，USA）标准操作规程，将纯化后的扩增片段构建PE 2*300 的文库。所测序列进行NCBI 文库的Blast 比对，比对出相似菌株。

1.8 利用16S rDNA 鉴定肠道菌群分离双歧杆菌时X-Gal 显色菌群范围

针对X-Gal 显色双歧杆菌BS 培养基所筛选菌株所有显色纯菌株，不经过其他鉴定方法，仅使用16S rDNA 测序的鉴定方法。将扩增序列进行NCBI 文库的16S rDNA 序列同源性比对，得出在双歧杆菌分离过程中所有显色菌株的大致范围。

2 结果与分析

2.1 采样液的筛选

3 种采样液及采样方式的显色菌落计数结果（p≤0.05）见表1。

表1 3 种采样液及采样方式的显色菌落计数结果（p≤0.05）

由表1 可看出，使用双歧杆菌BS 培养基作为采样液时显色菌落计数量普遍最高，培养基中L-半胱氨酸盐为双歧杆菌的生长提供更适宜其生长的还原性环境，能够更有效地保存粪便中的X-Gal 显色菌群，为后续双歧杆菌的分离培养提供分离基础和菌群环境；对比25%甘油溶液是3 种中最差的粪便显色菌群保持溶液，生理盐水与双歧杆菌BS 培养液计数结果较为接近且有一定差距。两者可以保存肠道菌群中显色菌群，但效果较差。后期分离出的双歧杆菌菌株有85%来自于双歧杆菌BS 培养基作为采样液的样品中。

2.2 双歧杆菌菌株的分离和鉴定结果

研究结果表明，鉴于双歧杆菌的生长要求的特点，选用X-Gal 与莫匹罗星锂盐改良的双歧杆菌BS培养基，既能抑制其他杂菌的生长，又能有较为明显的显色菌落。结果显示，分离出X-Gal 显色菌株，长寿老人组共挑选出50 株菌株，婴儿对照组共挑选出12 株菌株。

过氧化氢酶试验中，阳性菌株共29 株，阴性菌株共33 株。使用API 50CH 碳水化合物鉴定试剂条、HPLC 有机酸鉴定和16S rDNA 菌种鉴定的方法：百岁组共鉴定筛选出10 株双歧杆菌菌株，婴儿对照组共鉴定筛选出5 株双歧杆菌菌株。

15 株双歧杆菌菌种的菌落特征与菌落形态见表2。

2.3 显色菌株16S rDNA 同源性分析与鉴定

将62 株分离的显色菌株PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在1500 BP 左右有一条明亮的色带，满足测序要求，进行测序，并将测序结果在NCBA 中进行BLAST 比对，寻找数据库中与目的基因序列同源性最高的菌种，确定目的基因的归属[17]。

表2 15 株双歧杆菌菌种的菌落特征与菌落形态

X-Gal 显色菌株的16S rDNA 鉴定结果及其同源相似度如图1 所示，其中百岁老人组中有5 株动物双歧杆菌 （Bifidobacterium animalis）模式菌株 Bifidobacterium animalis subsp.DSM 10140(T)，3 株两歧双歧杆菌 （Bifidobacterium bifidum）模式菌株 Bifidobacterium bifidum BNCC186304，2 株长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）模式菌株 Bifidobacterium longum subsp.Longum JCM 1217；婴儿对照组中1 株动物双歧杆菌，2 株两歧双歧杆菌，2 株长双歧杆菌。

其他显色菌株中，百岁老人组有6 株经过鉴定为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）与模式菌株BCRC 14759(T)同源相似度性范围98.93%～99.39%，婴儿组未出现；百岁老人组有12 株硝化芽孢杆菌（Bacillus nitratireducens）与模式菌株 4049(T)相似度范围为98.6-99%，婴儿组未出现；百岁老人组有5 株鉴定为加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）与模式菌株ATCC 33323(T)相似度范围为98.93%～99.05%，婴儿组有2 株；百岁老人组有4 株鉴定为大肠杆菌LFHY_s 与模式菌株B1147 相似度范围为99.40%～99.76%，婴儿组未出现；百岁老人组有7 株鉴定为吕氏杆菌（Bacillus luti）与模式菌株TD41(T)相似度范围为98.91%～98.94%，婴儿组未出现；婴儿组有5 株鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）与模式菌株CECT 562(T)相似度范围为99.19%～99.75%，百岁老人组未出现；百岁老人组有5 株鉴定为阴道乳杆菌（PNGN_s）与模式菌株UMB0388 相似度范围为99.19%～99.75%，婴儿组未出现。

从长寿老人分离出的X-Gal 显色菌落种类比较繁杂且分散于各种杆菌及乳杆菌等，分离出的双歧杆菌菌株数较少，占总菌株数的24%；婴儿分离出的双歧杆菌比例较高，占42%，且显色菌株多为乳杆菌。由此可知双歧杆菌在婴儿肠道定殖的比例高于长寿老人，且分离较为容易。

X-Gal 显色菌株的16Sr DNA 鉴定结果见图1。

3 结论

双歧杆菌对生长条件的要求较为严苛，从多菌混样中分离双歧杆菌尚且不易，从人类粪便中更为困难。筛选3 种粪便样品采样液，使用双歧杆菌BS培养基作为采样液可以更有助于双歧杆菌的分离。在X-Gal 作为指示剂进行双歧杆菌分离时，从河南洛阳百岁老人粪便中分离出能够显蓝色的共50 株菌株，而对照组婴儿组分离出12 株显蓝色菌株。其中，百岁老人组共有10 株鉴定为双歧杆菌，婴儿组共有5 株鉴定为双歧杆菌，其所占比例分别为24%和42%。由此说明，百岁老人肠道中的双歧杆菌分离相较于婴儿更为困难。

图1 X-Gal 显色菌株的16Sr DNA 鉴定结果

X-Gal 在双歧杆菌的分离中不能作为该菌属的特异性指示剂，微生物只要能分泌出分解该指示剂的酶就能在分离时使菌落周围呈现蓝色。经过16S rDNA 菌种鉴定显示，在粪便双歧杆菌分离鉴定中显示蓝色的菌种大致是：唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）、硝化芽孢杆菌 （Bacillus nitratireducens）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、大肠杆菌LFHY_s、吕氏杆菌（Bacillus luti）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），以及大多数的双歧杆菌菌种。因此，以上菌种都能分泌β-半乳糖苷酶，从而分解X-Gal，使菌落周围显现蓝色。

通过研究发现，在粪便中分离双歧杆菌时，X-Gal 并不是唯一指示剂，研究结果给出了使用X-Gal 作为指示剂时显色菌落的大致菌种，且百岁老人的肠道菌群相较于婴儿更难分离。试验为后人提供更为清晰的肠道中双歧杆菌的分离步骤和方法，也为X-Gal 应用与肠道菌分离提供参考。