麦芽糖醇标准样品的研制

段文娟，李月，耿岩玲，王晓

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省分析测试中心 山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014)

标准样品是由国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会批准的实物标准，是标准的另一种存在形式，是标准化技术发展到一定阶段的产物，其与文字标准合在一起构成完整的标准形态[1]。GB/T 15000.3—2008和ISO指南35—2006规定标准样品为一种或多种规定特性足够均匀和稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预备用途，用途可包括测量系统校准、测量程序评估、给其他材料赋值和质量控制[2]。随着标准样品在确保测量结果的准确、可靠，与国际等效，在方法验证、实验室评估和仪器校准等方面的广泛应用，其地位和作用日益显著。

图1 麦芽糖醇的化学结构式Fig.1 Chemical structure of maltitol

麦芽糖醇的化学名称为4-O-α-D-吡喃葡萄糖基山梨醇，分子式为C12H24O11(图1)，是麦芽糖加氢还原后精制而成的一种双糖醇[3]，甜度为蔗糖的0.8～0.9倍，甜味温和，是一种新型的功能性甜味剂。麦芽糖醇在动物体内很难被消化代谢，热值仅为蔗糖的十分之一，耐酸性和耐热性优于蔗糖、木糖醇和山梨糖醇[4]。研究表明麦芽糖醇可显著提高钙的吸收和保留率[5]、预防龋齿[6]、不刺激胰岛素分泌、维持血糖稳定[7]，是一种理想的甜味剂。麦芽糖醇是一种安全、无毒害的食品添加剂，其安全性得到国家食品药品监督管理总局、联合国食品和农业组织、世界卫生组织认可，可添加于各类动物性食品中，且对添加限量不做规定[8]。近年来，麦芽糖醇已广泛用于食品、化工、保健品及化妆品行业。我国也出台了相关标准[9-10]，建立了相关产品中麦芽糖醇含量测定方法，以确保产品质量。但我国目前没有麦芽糖醇国家标准样品，为了满足产品分析检测和质量控制的需求，本研究以市售麦芽糖醇为原料，按照GB/T 15000标准样品研制的系列工作导则的要求，经过分离纯化、结构鉴定、纯度分析、均匀性检验、稳定性检验和定值，研制出纯度大于99%、不确定度小于1%的麦芽糖醇国家标准样品，为麦芽糖醇的深入研究以及相关产品的分析检测和质量控制提供物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)385-ELSD蒸发光散射检测器及色谱工作站；岛津LC-6AD制备液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)；旋转蒸发仪R-3(瑞士BUCHI公司)；Agilent 6520 Q-TOF液相质谱仪(美国Agilent公司)；TG-40 DTA-40M型热重分析仪(日本SHIMADZU公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU公司)；WRS-1B型数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)；Vertex 70红外光谱仪(德国BRUKER公司)；BRUKER 400 MHz核磁共振波谱仪(德国BRUKER公司)；冷冻干燥仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Direct-Q8超纯水机(法国Merck Millipore公司)。

1.2 材料与试剂

麦芽糖醇对照品(市购)，乙醇、甲醇为分析纯(天津广成化学试剂有限公司)，高效液相色谱用甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司)，水为实验室自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

在独立和洁净的操作间，采用2 mL棕色样品瓶将麦芽糖醇粉末分装，每瓶10 mg，共分装120瓶，以1～120号计，分装好的样品在4 ℃冰箱保存。

2.2 纯度分析

2.2.1 分析条件

2.2.2 样品溶液制备

精密称取木糖醇样品2.0 mg，加1.0 mL超纯水超声溶解，过0.45 μm微孔滤膜过滤，得到2 mg/mL的样品溶液。麦芽糖醇的高效液相色谱图见图2。

图2 麦芽糖醇的HPLC图谱 Fig.2 HPLC chromatogram of maltitol

2.2.3 薄层鉴别

(a) V(正丁醇) V(乙醇) V(水)=1 (b) V(异丙醇) V(水) V(氨水)=1 图3 麦芽糖醇的薄层彩色图谱Fig. 3 TLC chromatogram of maltitol

2.2.4 热重分析

精密称取样品5 mg，放置于热重用的坩埚中，分析条件：初始温度为35 ℃，最终温度为800 ℃，以10 ℃/min的速率升温，气体N2，流速100 mL/min。分析结果显示，温度在35.0～262.0 ℃内，热重(TG)曲线无明显变化，说明被测试的样品中基本不含吸附水或者挥发性物质，且样品的热稳定性好。当温度增加超过262.0 ℃时，样品开始分解。麦芽糖醇的热重分析图谱见图4。

2.3 结构鉴定

采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、高分辨质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振(NMR)对样品的结构进行鉴定，结果表明与文献[11]报道的数据一致。

2.3.1 紫外光谱检测

麦芽糖醇(超纯水)在190～600 nm的波长内，除末端吸收外，在其他波长范围内无紫外吸收，结果如图5所示。

图5 麦芽糖醇的紫外光谱图 Fig.5 UV spectrum of maltitol

2.3.2 红外光谱分析

称量样品10 mg与KBr混合均匀并压片，扫描波数在400～4000 cm-1范围测定红外光谱，解析结果见表1。

表1 麦芽糖醇的红外光谱数据Table1 IR data of maltitol

2.3.3 高分辨质谱分析

高分辨质谱分析条件：电喷雾离子源，载气为氮气，载气流速为10 L/min，载气温度为300 ℃，毛细管电压为4.0 kV，扫描范围m/z为100～1000。

实测值是m/z=367.124 0 [M-H]-，计算值是m/z=343.123 9 [M-H]-；实测值是m/z=367.121 6 [M+Na]+，计算值是m/z=367.122 6 [M+Na]+；推测分子式为C12H24O11。

2.3.4 核磁共振波谱分析

麦芽糖醇样品溶于D2O中，分别测定1H NMR和13C NMR数据，与文献[11-12]报道对比，基本一致，核磁数据归属见表2。

表2 麦芽糖醇的核磁共振氢谱和碳谱数据(氘代溶剂D2O)Table 2 NMR and carbon spectral data of maltitol (deuterated solvent D2O)

2.4 均匀性

表3 麦芽糖醇均匀性测量数据Table 3 Homogeneity test data of maltitol

表4 麦芽糖醇均匀性检验的方差分析Table 4 Variance analysis for the homogeneity test of maltitol

2.5 稳定性

根据标准样品工作导则GB/T 15000.3—2008标准样品定值的一般原则和统计方法中第8章稳定性研究的要求，将麦芽糖醇样品储存在棕色干燥器中常温避光保存，以两年为期，开展实时稳定性研究，对样品的稳定性进行评估。每6个月对放置在棕色干燥器中的样品取样检验，采用2.3.1项下建立的HPLC纯度分析方法进行测定，每份试样平行测试5次，峰面积归一化法进行纯度计算，采用t检验对数据进行统计分析并计算样品稳定性引入的不确定度[2]。结果见表5。

表5 麦芽糖醇样品稳定性检验的实验结果Table 5 Stability test data of maltitol

采用单变量线性模型-线性最小二乘法计算得到截距b0和斜率b1以及相应的标准偏差s(b1)。斜率b1的计算公式如下所示：

(1)

截距b0的计算公式如下所示：

(2)

直线上每点的标准偏差的计算公式如下所示：

(3)

其平方根s=0.018，与斜率相关的不确定度的计算公式如下所示：

(4)

自由度为n-2=3和置信水平p=0.95(95%的显著水平)条件下，t检验的临界值等于3.182，即t0.95,n-2=3.182。由于式(5)

|b1|

(5)

故斜率并不显著，因此，此样品在24个月内是稳定的。

有效期为24个月的长期稳定性引入的不确定度贡献为：

ults=s(b1)×t=0.01%×24=0.24%。

(6)

2.6 定值

本样品按照标准样品工作导则GB/T 15000.3—2008[2]的要求，由多家实验室采用同一种方法协作定值，参与实验室的数目为8个。随机抽取24瓶样品，每个定值实验室送3瓶，定值实验室将样品配成一定浓度的溶液，每瓶样品用高效液相色谱仪平行测定2次，采用峰面积归一化法进行定值[2, 13]。对测定的结果进行单因素方差分析，分析结果见表6～8。

表6 8家实验室定值数据Table 6 Certification data of 8 laboratories

表7 HPLC纯度定值结果的方差分析表Table 7 Variance analysis results ofcertification data by HPLC

表8 HPLC纯度定值结果的统计分析表Table 8 Statistic analysis of certification data by HPLC

数据统计的计算公式为：

3 讨论

本研究根据GB/T 15000.3—2008标准样品系列导则[2]的要求，对纯化的麦芽糖醇样品进行了均匀性、稳定性和定值研究。麦芽糖醇标准样品的总不确定度由标准样品定值分析引入的不确定度、均匀性实验引入的不确定度和长期稳定性引入的不确定度3部分组成。采用统计学方法对数据进行处理，麦芽糖醇标准样品的定值结果为：标准值为99.64%，置信水平为95%的扩展不确定度为0.50% (p=0.95,k=2)，该标准样品的研制程序符合国家市场监督管理总局对标准样品研制的相关要求。该标准样品的研制为麦芽糖醇相关产品的测量校准、质量控制、方法确认等工作提供了物质基础，确保了测量结果的准确性、可比性、溯源性以及国际等效。同时，本研究为低聚糖类国家标准样品的研制提供了研究范例。