“化浊解毒方”对二恶英暴露2型糖尿病大鼠脂代谢及胰岛素抵抗的影响

郭胜男 刘弘毅 吴深涛

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津300380；2.云南中医药大学第一附属医院，云南昆明650000）

目前，全球2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM） 的患病人数呈爆炸性增长，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛素分泌受损是T2DM发生、发展的两大病理生理基础，传统观念认为不良的生活方式（如久坐少动）和不健康的饮食习惯（如高脂饮食）是导致肥胖、IR和T2DM的主要原因，但这些常规危险因素已不能解释全球范围内与IR相关的代谢性疾病的飞速增长，然而却与近50年工业发展呈一致趋势。随着全球工业的发展，环境污染日益加剧，持续性有机污染物（persistent organic pollutants，POPs）是环境污染物中最具代表性的有毒化学物质[1]，这类化合物具有理化性质稳定、难降解、亲脂性、疏水性、远距离传输、高蓄积性等特点，并且能够通过食物链进入人体内并产生生物放大效应[2]，最终蓄积在人体（血液、脂肪、母乳等）中，并且很难从人体代谢或排泄出去，对人类健康产生潜在的负面影响[3]。有证据表明，POPs暴露会导致胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生[4]。

早期研究发现，脂毒性与脂代谢异常既是胰岛素抵抗的结果，又是胰岛素抵抗的重要致病因素[5]。我们前期研究表明，化裁自升降散的化浊解毒方在改善SD大鼠糖、脂毒性相关IR方面有显著的疗效[6-7]。本研究选取POPs中典型的有机污染物——二恶英，建立2型糖尿病大鼠（ZDF大鼠）染毒模型，观察化浊解毒方对二恶英暴露的ZDF大鼠糖脂代谢及IR的影响，揭示化浊解毒方如何解“环境污染之毒”，为其进一步临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物及饲料 SPF级雄性ZDF（fa/fa）大鼠，6周龄，体重180～200 g；SPF级雄性ZDF（fa/+）大鼠，6周龄，体重140～160 g。大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。PMI Labdiet5008饲料：成分为粗蛋白24%、粗脂肪7.1%、粗纤维3.2%、无氮浸出物48.9%、矿物质（有机物）6.7%、维生素3.2%，购自雍立（上海）生物科技有限公司。大鼠饲养于屏障级实验动物中心（配备独立通气饲养笼），控制温度20～25 ℃，湿度（55±10）%，12 h明暗交替照明（光照时间7∶00—19∶00）。实验期间，动物自由摄食进水，每日更换垫料，保持笼内干燥、清洁。

1.2 实验药物 二恶英混标（成分：2,3,7,8-Tetrach lorodibenzo-p-dioxin，1,2,3,7,8-Pentachlorodibenzop-dioxi，1,2,3,4,7,8-Hexachlorodibenzo-p-dioxin，1,2,3,4,6,7,8-Heptachlorodibenzo-p-dioxin，Octachlorodibenzo-p-dioxin），购自美国AccuStandard公司；化浊解毒方颗粒（组成：黄连、大黄、姜黄、蝉蜕、僵蚕、枳实、清半夏、白芍、柴胡、黄芩、干姜、佩兰），由天津中医药大学第一附属医院药厂制备，批号：津药制字（临）Z20130944。

1.3 试剂与仪器 碘[125I]胰岛素放射免疫试剂盒，购自北京北方生物技术研究所；游离脂肪酸测定试剂盒（比色法），购自南京建成生物工程研究所。罗氏血糖仪（型号：ACCU-CHEK），购自德国罗氏诊断有限公司；血糖试纸（型号：ACCU-CHEK），购自德国罗氏诊断有限公司，批号477493；SN697双探头全自动放免γ计数器，购自上海核所日环光电仪器有限公司；全自动生化分析仪（规格型号：7020型ISE），购自日本日立公司；电子天平（型号：KFS-3000），购自浙江凯丰集团公司；低速多管架自动平衡离心机（型号：TDZ5-WS），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产；分光光度计（型号：723S），购自上海棱光技术有限公司。

2 实验方法

2.1 分组与染毒、药物干预 选取6周龄雄性ZDF（fa/fa）大鼠为模型鼠，以普通饲料适应性饲养1周，按照随机数字表法随机分为模型组与二恶英染毒组，另取6周龄雄性ZDF（fa/+）大鼠为正常组。实验全程正常组予普通饲料喂养，模型组、二恶英染毒组予ZDF专用饲料PMI Labdiet5008喂养。二恶英用玉米油溶解，以50 ng/kg灌胃二恶英染毒组大鼠染毒，模型组和正常组以等体积玉米油灌胃，每日灌胃1次，共8周。随后将二恶英染毒组大鼠随机分为染毒组与化浊解毒方组。依据《中国临床药理学与治疗学》中的公式以及我们前期研究，化浊解毒方高剂量（6.0 g·kg-1·d-1）在降糖降脂及改善胰岛素抵抗等方面明显优于低剂量（1.5 g·kg-1·d-1）及中剂量（3.0 g·kg-1·d-1）[8-9]，因此本研究化浊解毒方组按生药6.0 g·kg-1·d-1灌胃给药，其他各组以等体积生理盐水灌胃，共4周。最终各组选择6只大鼠进行指标检测。

2.2 口服葡萄糖耐量试验（OGTT） 治疗后对各组大鼠进行OGTT。大鼠禁食不禁水12 h，于上午7时对各组大鼠依次剪尾，使用血糖仪检测空腹血糖（FBG），随后用50%葡萄糖以2 g/kg的剂量灌胃，在灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min时再次剪尾检测血糖浓度。

2.3 空腹血清胰岛素（FINS）及血脂指标检测 药物干预结束后各组大鼠目内眦取血，将收集到的血浆样本置于离心机中，离心半径157 mm，3 000 r/min离心10 min，收集血清，检测空腹血清胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）及游离脂肪酸（FFA）。

2.4 计算胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数 参照李光伟教授[10]发表的相关胰岛素抵抗计算公式，进行计算。胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI）=FBG×FINS/22.5，胰岛素敏感指数（HOMA-ISI）=Ln[1/（FBG×FINS）]。

2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件包进行统计学处理，数据采用（x-±s）表示，计量资料比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），2组间数据比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠治疗后OGTT结果比较 见表1。

3.2 各组大鼠治疗后空腹血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数及胰岛素敏感指数比较 见表2。

3.3 各组大鼠治疗后血脂水平比较 见表3。

4 讨论

各国许多大规模流行病学研究已经确定了POPs与胰岛素抵抗以及T2DM之间密切相关，尤其是近10年来，全球至少有20个横断面研究和近10个纵向研究证实了这一观点。POPs不仅造成环境污染，而且90%可通过饮食摄入危害人体健康。研究发现，胎儿在子宫内暴露POPs极大增加成年后罹患糖尿病的风险[11]。虽然POPs自20世纪70年代已被禁止或限制使用，但其高稳定性、高亲脂性及高生物蓄积性，其危害仍然持续存在。我国长三角、珠三角当地环境中POPs含量显著高于美国等其他国家风险阈值[12-15]，河北省POPs人体负荷水平6年间上升了25%[16]。因此，研究开发新的药物以防治POPs对人体的持续危害是目前亟须解决的问题。本研究结果进一步证明，二恶英暴露会导致ZDF大鼠胰岛素抵抗，且能够使TC、TG与FFA的水平升高。POPs导致IR具体的分子机制尚未阐明，有研究发现低剂量二恶英暴露引起线粒体出现去极化现象，胰岛细胞对血糖刺激的敏感性显著降低，随着二恶英剂量加大，线粒体嵴出现肿胀，表现出明显的细胞毒性[17]。

游离脂肪酸及甘油三酯是造成脂毒性的核心物质，脂毒性会促进炎症和IR，IR反过来会加重脂毒性。IR是造成机体代谢紊乱的关键因素，造成高血糖和脂代谢紊乱，是引发脂毒性及多种并发症的重要因素。因此二恶英可能是通过脂毒性导致胰岛素抵抗。胰岛素抵抗可以由各种情况引起，包括异常的胰岛素信号传导、脂毒性、炎症、线粒体功能障碍和内质网（ER）应激等[18]。二恶英是否通过其他途径导致胰岛素抵抗，还有待进一步研究。

葡萄糖耐量试验是目前诊断糖代谢异常的标准方法，其结果可以反映胰岛β细胞分泌功能以及机体对血糖的调节能力。本研究结果表明，化浊解毒方对染毒大鼠葡萄糖耐量具有改善作用。

表1 各组大鼠治疗后口服糖耐量试验结果比较（x-±s） 单位：mmol/L

表2 治疗后各组大鼠空腹血清胰岛素水平和胰岛素抵抗、胰岛素敏感指数比较（x-±s）

表3 治疗后各组大鼠血脂水平比较（x-±s）

胰岛素作为机体内唯一具有降低血糖作用的激素，对维持体内葡萄糖稳态有极其重要的作用。IR导致胰岛素对其靶器官的生物效应降低，致染毒大鼠胰岛β细胞代偿分泌胰岛素，并出现高胰岛素血症。本研究结果表明，化浊解毒方能有效降低二恶英染毒大鼠空腹胰岛素水平，改善大鼠高胰岛素血症，其机制与其对染毒大鼠胰岛素抵抗的改善作用有关。

化浊解毒方以清代医家杨栗山之古方升降散化裁，全方“取僵蚕、蝉蜕升阳中之清阳，姜黄、大黄降阴中之浊阴，一升一降，内外通和，而杂气之流毒顿消矣”（《寒温条辨》卷四））。更以黄连清胃肠之热，合大黄为君清热解毒，荡涤浊邪；加柴胡、黄芩为臣清利少阳，泻肝胆而疏理脾胃；白芍柔肝敛阴，辅佐以不伤阴；枳实理气导滞行浊；清半夏降浊合黄连辛开苦降，疏畅中焦；佩兰和胃化浊消脾瘅，干姜辛温以暖中焦，两者相合亦制他药之苦寒。全方共奏化浊解毒、清肝和胃之功。本研究结果表明，化浊解毒方能够降低二恶英暴露大鼠TC、TG、FFA及空腹血糖，改善糖耐量及IR，提高胰岛素敏感性。

综上，我们可以推测，化浊解毒方改善二恶英暴露大鼠的胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱，可能与其改善糖脂毒性有关，进一步说明，化浊解毒方不仅能解糖脂之毒，亦可能解环境污染之毒，做到真正意义上的解毒，为未来代谢药物的开发提供理论依据。中药复方具有多靶点、多途径调节机体内代谢平衡的作用，今后实验中，我们将重点探讨化浊解毒方对二恶英暴露大鼠肝、胰及脂肪等病理及分子生物学指标方面的影响，进一步揭示化浊解毒方解环境污染之毒的具体机制。