核内不均一核糖核蛋白D和上皮细胞黏附分子在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其意义

班硕丰，张诗晨，孙一丹，王 婧，韩 冰

(1.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春 130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021)

研究[1-2]显示：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)发病率居世界恶性肿瘤发病率的第六位，也是最常见的头颈部恶性肿瘤，主要发生在口腔黏膜如舌、口底、颊和牙龈等处。OSCC经常发生侵袭和远处转移[3]，严重威胁患者生命。核内不均一核糖核蛋白D(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，hnRNPD)亦称AUF1，是hnRNP家族中的成员，是一种核酸结合蛋白。研究[4-5]表明：hnRNPD参与调节多种生物学途径，与炎症、癌症、心血管疾病、衰老和病毒感染等多种疾病相关。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是一种相对分子质量为40 000的跨膜表面糖蛋白。EpCAM在多种上皮源性癌组织中高表达，而在正常上皮组织中低表达，因此被认为是一种肿瘤标记物[6]。目前有关hnRNPD和EpCAM在OSCC组织中表达情况的报道较少，并且结论并不完全一致。本研究采用免疫组织化学SP法检测OSCC患者OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达情况，探讨hnRNPD和EpCAM在OSCC组织中表达的意义，为其在OSCC临床诊断和治疗中发挥作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年6月—2019年6月吉林大学口腔医院手术切除的38例经病理检查确诊的OSCC组织标本(OSCC组)，均为原发病灶。标本来源患者均为首次手术，术前未经放、化疗，患者临床资料完整。患者年龄24～77岁，中位年龄56岁，男性30例，女性8例；临床TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；组织病理学分级：高分化12例，中分化21例，低分化5例。另在正常拔牙患者口腔内采集正常黏膜组织11例(对照组)。

1.2 主要试剂和仪器hnRNPD兔抗人多克隆抗体和EpCAM兔抗人多克隆抗体(美国Proteintech Group Inc公司)，免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，枸橼酸盐缓冲液和抗体稀释液(北京中杉金桥生物技术有限公司);超薄切片机(德国Leica Biosystems 公司)，显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 免疫组织化学SP法检测OSCC组织和正常口腔黏膜组织中hnRNPD和EpCAM表达水平全部组织标本离体后立即置于10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片。常规脱蜡水化后，采用枸橼酸盐缓冲液微波修复，按照即用型免疫组织化学超敏SP检测试剂盒说明书进行染色。其中hnRNPD一抗(1∶200)和EpCAM一抗(1∶200)4℃孵育过夜，DAB显色时间控制在1.5～2.0 min，以PBS代替一抗作为空白对照组。

1.4 结果判定标准由病理科医师在双盲条件下对每个样本切片选取5个癌细胞聚集的高倍镜视野，采用Image Pro Plus v6.0分析其平均光密度(mean optical density，MOD)值，以MOD值表示样本的染色强度。

2 结 果

2.1 OSCC组织和正常黏膜组织中hnRNPD和EpCAM表达水平OSCC组hnRNPD主要表达在细胞核，呈棕色或褐色；而对照组hnRNPD染色呈淡黄色或黄色，且着色细胞数较少。OSCC组EpCAM主要表达在细胞膜，少量表达在细胞质，染色呈棕黄色或褐色；对照组EpCAM表达较少且染色减弱。OSCC组和对照组hnRNPD和EpCAM表达水平均呈非正态分布，方差齐性检验结果显示：hnRNPD和EpCAM表达水平方差不齐。OSCC组和对照组中hnRNPD和EpCAM表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图1(插页八)和表1。

2.2 OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平的相关性分析38例OSCC患者OSCC组织中hnRNPD表达水平和EpCAM表达水平分别为[1.88(1.06,3.96)]×10-2和[0.35(0.09,1.50)]×10-2,两者相关性较弱(Spearman相关系数ρ=0.227，P=0.17)，OSCC组织中hnRNPD与EpCAM的表达无相关性。

表1 正常黏膜组织和OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平

2.3 不同临床病理特征患者OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平对38例OSCC组织样本按照性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、病理分期和淋巴结转移情况分别分组，组间比较采用非参数秩和检验分析结果显示：不同性别和不同年龄OSCC患者OSCC组织中EpCAM表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；不同临床病理特征OSCC患者OSCC组织中hnRNPD表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征OSCC患者OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平

Tab.2 Expression levels of hnRNPD and EpCAM in OSCC tissue of OSCC patients with different clinicopathological parameters

Clinicopathological parameternMOD of hnRNPD(×10-2)ZPMOD of EpCAM(×10-2)ZPGender Male Female3082.11(2.05,3.55)1.28(0.89,1.97)-1.5750.1150.40(0.67,2.16)0.07(0,0.52)-2.4710.013Age(year) ≤60 >6024141.28(1.52,3.20)2.36(1.76,3.78)-1.3320.1830.25(0.26,1.66)0.55(0.27,2.75)-1.9670.049Size of tumor ≤4 cm >4 cm27111.52(1.69,3.21)2.10(1.37,3.95)-0.5310.5950.35(0.46,2.10)0.42(0.11,1.66)-0.1130.910TNM stage Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ23151.52(1.62,3.16)2.10(1.53,3.86)-0.4030.6870.32(0.24,1.83)0.63(0.32,2.42)-0.9110.362Pathological stage Ⅰ Ⅱ-Ⅲ12261.27(2.05,3.55)2.36(2.08,3.71)-1.7270.0840.33(0.16,0.90)0.39(0.59,2.33)-0.4080.683Lymph node metastasis Positive Negative28101.52(0.83,3.94)2.03(1.85,3.27)-0.4310.6670.64(0.04,3.21)0.31(0.34,1.66)-0.7290.466

3 讨 论

作为一种核酸结合蛋白， hnRNPD通过与多种mRNA和DNA序列结合来调控基因表达，其参与机体多种病理生理过程，如细胞增殖、分化、衰老、免疫和癌变等。研究[7-9]表明：hnRNPD在多种恶性肿瘤，如甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌和小鼠肺部肿瘤等组织中均呈现过表达，显示其与肿瘤的发生发展有着密切关联。但也有研究[10]表明：hnRNPD有抑制肿瘤的作用。hnRNPD减少了促血管生成因子的产物[11]可能是其抑制肿瘤的机制之一。EpCAM不仅在细胞间黏附中发挥作用，还在细胞信号传导、增殖和分化等方面发挥重要作用，在人体部分正常上皮细胞和大多数恶性肿瘤细胞中均表达[10]，并且在多数上皮性肿瘤[6]、腺癌[12]和急性髓细胞性白血病[13]组织中表达上调。在正常细胞中，EpCAM似乎被隔离在紧密的连接中，因此抗体难以接近，而在癌细胞中，EpCAM广泛分布在细胞表面[14-15]。LEE等[16]研究证明：EpCAM在腺样囊性癌中表达上调并与多个临床特征相关。EpCAM在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、尿路上皮癌和胆囊癌等组织中的高表达与预后不良相关，而在肾癌和甲状腺癌组织中的高表达则与生存率提高有关[6,17]，这可能是因为EpCAM参与细胞黏附，也有研究[18]证明：EpCAM基因突变可导致先天性簇状肠病和林奇综合征。

OSCC严重威胁患者生命，其发生与多种信号通路和相关蛋白的表达有关[19]。本研究结果显示：OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平均上调，显示二者与OSCC发生发展相关。KUMAR等[20]研究亦证明： OSCC组织中hnRNPD高表达，同时显示hnRNPD表达与肿瘤大小和肿瘤分期有关；ZHANG等[21]研究显示：hnRNPD是OSCC患者生存相关的剪切因子之一，与肿瘤的发生有关。本文作者进一步分析发现：hnRNPD表达水平与患者临床病理参数无明显关联，原因可能为本实验样本量较少；EpCAM表达水平仅与患者的性别和年龄有关联。SEN等[22]研究证明： OSCC组织中EpCAM高表达，并且其表达情况与肿瘤大小、病理分级、局部肿瘤复发情况和患者生存率有关联，而LAIMER等[23]研究结果则显示：OSCC组织中EpCAM表达与肿瘤分级、临床分期、淋巴结转移和受体状态无明显相关性。对于EpCAM与临床病理特征的关系尚无定论。HAYRY等[24]在研究中采用EpCAM作为标志物，对头颈部鳞状细胞癌转移的淋巴结细胞检测的效果较好。恶性肿瘤的发生发展中往往有2种或多种物质发生协同或拮抗作用[25-26]。本文作者对hnRNPD和EpCAM表达相关性分析结果显示：OSCC组织中hnRNPD和EpCAM表达水平相关关系较弱，提示在OSCC的发生发展中，hnRNPD和EpCAM所在的信号通路可能是2个关联较少或不相关联的系统。

综上所述，hnRNPD和EpCAM与OSCC存在密切关联。未来仍需进一步研究二者参与OSCC发生发展的机制，以期为将hnRNPD和EpCAM表达水平作为OSCC诊断和治疗的靶点提供进一步的理论基础。