骨碎补总黄酮对去势大鼠骨质疏松的防治作用

王永胜 胡菁菁 卢育南 钟凯龙

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构异常及骨骼脆性增加并容易发生骨折为基本特征的代谢性骨病[1]。当人体内的成骨或破骨细胞因发生数量和功能异常变化时，骨吸收和骨形成的动态平衡则会被打破[2]，引起骨组织生理代谢发生变化最终引起骨质疏松（osteoporosis，OP）。绝经后的骨质疏松症是一种严重危害健康的代谢性骨病，主要归咎于人体雌激素水平的降低[3]。当前骨质疏松的临床治疗方法较多[4]，中药的治疗尤其突出[5]。骨碎补总黄酮（rhizoma drynariae total flavones，RDTF）从骨碎补根茎中提取获得，已有相关研究发现RDTF 对OP 防治作用及可能作用机制[6]。本实验在成功制备去势诱导的OP 动物模型基础上，观察RDTF 对卵巢去势诱导骨质疏松模型大鼠的骨密度和组织形态学的影响。为今后进一步其机制研究提供有力支持。

1 药品、动物及试剂材料与方法

1.1 一般材料

本研究起止时间为2018 年10 月—2020 年1 月，选择3 月龄斯普拉格道利（sprague dawley，SD）大鼠50只，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，雌性大鼠，体质量（180±16）g，购于上海克莱勒实验动物中心。强骨胶囊（有效成分0.142 g，批号：181101，北京歧黄制药有限公司）。包埋机（BMJ-A，常州中威电子仪器），显微镜（BA210T，Motic）， DXA（Norland-XR36）。

1.2 研究方法

随机分三组：Sham 组、OP 组、RDTF 组（每组7 只）。予10%水合氯醛（CAS: 302-17-0，含量99.5%；规格：250 g；生产厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司）0.3 mL/100 g 剂量深度麻醉，手术切除OP 组和给药组大鼠双侧卵巢，假手术（Sham-operated，Sham）组只切除腹腔中少量软组织和脂肪。术后饲养3 个月后给药干预，Sham 组和OP 组蒸馏水灌胃。RDTF 组按0.054 g/（kg·d）剂量灌胃。连续给药3 个月。取材前禁食24 h，麻醉后手术暴露其股骨头，用洁净咬骨钳将其钳碎，用无菌eppendorf（EP）管收集并标记。

1.3 观察指标

骨密度（bone mineral density，BMD）检测，大鼠麻醉后，正位放置定位板，四肢伸展。应用DXA 采用小动物模式扫描，测量各组大鼠左侧股骨BMD。

1.4 HE 染色

图1 大鼠股骨BMD 扫描图（左）；大鼠股骨组织切片（HE 染色，×100）（右）

大鼠股骨组织剪碎成约3 mm，4%多聚甲醛液（pH=7.4）4℃固定48 h。使用10%EDTA-2Na（PH =7.4）在4℃条件下脱钙一个月，脱钙液每周更换一次。脱钙结束，石蜡包埋连续切片。切片的厚度约4 μm，置65℃的恒温烘箱中烤6 h。将组织切片常规脱蜡染色制片。光镜下观察HE 染色情况。

1.5 统计学处理

采用 SPSS 17.0 软件统计分析数据，计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度检测

OP 组 大 鼠 股 骨BMD 值（0.366±0.033）mg/cm2显 著 低 于Sham 组（0.465±0.008）mg/cm2（P ＜0.05），表明造模成功。RDTF 组骨密度（0.400±0.048）mg/cm2显著高于OP 组。

2.2 大鼠股骨组织HE 染色

如图1，Sham 组大鼠股骨组织形态结构较为完整，骨髓腔中央可见骨细胞，骨小梁粗细一致，无断裂现象，骨小梁之间间隙较小且相互连接形成网络结构。OP 组大鼠，骨组织形态结构不完整，骨小梁细小而松散，间距增大，骨小梁间连接点较少，分布稀疏且凌乱，游离末端增加，骨髓腔融合较严重，呈现出骨质疏松典型性病理形态学改变。与OP 组相比较，骨小梁数量增多，骨碎补总黄酮组大鼠股骨组织可见增厚的骨小梁，其连接点也增多。

3 讨论

OP 是一种易于发生骨折的全身性骨骼病，其特征为骨的微观结构退化、骨量减少、以及骨脆性增加、松质骨中骨小梁数量减少体积变小[7]。传统医学认为“肾主骨”，骨碎补味苦入肾经，具有补肾强骨、养伤止痛之功效，临床上广泛应用于肾虚腰痛、跌打骨伤[8]。骨碎补其主要成分有β-谷甾醇等黄酮类物质、PYD 等[9]。

本研究使用的有效成分RDTF，运用DXA 观察其对OP 模型骨密度影响，结果显示，RDTF 可显著提高大鼠BMD。HE染色镜下见OP 组股骨骨组织形态结构较不完整，骨小梁断裂、丢失严重，骨小梁间连接点减少，游离末端变多，呈凌乱稀疏样分布，间距扩大，骨髓腔严重融合，呈典型性骨质疏松病理形态学改变，提示造模成功。在持续给予RDTF 12 周后，该组骨小梁变厚，断裂减少，连接点增多，排列趋规则，表明RDTF 可显著改善OP[10]。目前骨转换生化标志物如 BGP、BALP、PTH 等广泛应用于临床诊疗、研究中[11]，结合BMD，获悉骨转换动态，在评价抗骨质疏松的治疗疗效等方面具有重要作用[12]。

综上所述，骨碎补总黄酮对去势诱导的骨质疏松具有明显的防治作用。但其相应地作用机制仍有待进一步研究。