牡荆素对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠类风湿关节炎的缓解作用及对血浆Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影响

亓洪德 卢 程 李 庭 亓会涛 高圣龙

(山东省济南市人民医院创伤骨科，济南 271100)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一种以晨僵、关节肿痛、活动受限为主要临床症状的慢性炎症性自身免疫性疾病，最终会导致关节畸形及功能丧失，严重影响患者生活质量[1-3]。RA的发病原因和机制复杂，难以根治，新药物的开发是治疗RA的新希望。牡荆素是从中药材牡荆叶和牡荆子中提取的天然黄酮类化合物，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤、保护心脏、保护神经等多种生理作用[4-8]，但对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠RA作用机制尚未明确。辅助性T细胞17(T helper 17 cell，Th17)是能够分泌IL-17的T细胞亚群，辅助性T细胞23(T helper 23 cell，Th23)是能够分泌IL-23的T细胞亚群，在RA患者病灶部位高表达，并与RA的严重程度有关[9]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类依赖钙锌等金属离子的内肽酶家族，在RA中参与细胞外基质重构[10]。本文研究牡荆素对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠RA的作用及对血浆Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠购自四川大学实验动物中心，牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司，牡荆素购自上海恒远生物科技有限公司，HE染色试剂盒购自舜百生物科技有限公司，BCA试剂盒购自上海晶康生物工程有限公司，IL-17和 IL-23 ELISA试剂盒购自上海酶联科技生物有限公司。

1.2方法

1.2.1造模 无菌条件下配制1 mg/ml的牛Ⅱ型胶原乳液(0.1 mol/L醋酸溶解的2 mg/ml的牛Ⅱ型胶原与等体积的弗氏完全佐剂混合)。造模方法参考文献[11]：模型组每只大鼠尾根部分皮内注射0.3 ml 牛Ⅱ型胶原乳液，第15天，同等方法同剂量再次注射牛Ⅱ型胶原乳液；对照组注射等体积生理盐水。

1.2.2分组及给药方式 将SD大鼠随机分为健康对照组(Control组)、模型组(Model组)和给药组[Vitexin(1.5 mg)组、Vitexin(3 mg)组、Vitexin(6 mg)组]5组，每组10只。造模52 d后，给药组每天分别腹腔注射牡荆素1.5、3、6 mg/kg，连续3周；健康对照组和模型组注射等体积生理盐水。

1.2.3HE染色 将大鼠软骨组织分离，甲醛固定、酒精脱水、石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡、酒精至水，苏木精水溶液和伊红染色液染色，酒精脱水、二甲苯透明，封片观察。

1.2.4Western blot检测蛋白含量 提取总蛋白后用BCA试剂盒检测蛋白浓度，将待测蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至PVDF膜，封闭液中封闭；加入对应的一抗，4℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育，暗室中化学发光剂显色成像。

1.2.5ELISA及检测IL-17和IL-23表达 将样品加入用纯化的抗体包被的微孔板，并加入生物素化抗体和 HRP 标记的亲和素，底物 TMB 显色，酶标仪测定吸光度，计算样品浓度。

1.2.6流式细胞术检测CD4+IL-17+、CD4+IL-23+数量 分别取抗凝血100 μl加入不同测定管，加入CD4+IL-17+、CD4+IL-23+抗体混匀，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液混匀，室温避光孵育10 min，冰PBS洗涤3次，流式细胞仪检测。

1.2.7RT-PCR检测MMP-1、MMP-3、MMP-13表达水平 Trizol试剂提取RNA并逆转录为cDNA，进行RT-PCR检测。96℃预变性30 s,96℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸10 s，共30个循环；4℃保存。以β-actin为内参。

2 结果

2.1牡荆素减轻RA大鼠软骨损伤 通过HE染色病理切片镜检发现：Control组大鼠关节软骨结构完整，腔内无渗出液，滑膜组织正常；Model组关节间隙狭窄，可见炎症细胞浸润，并伴有血管翳形成；给药组病理症状明显减轻，且呈剂量依赖性减轻，见图1。

2.2牡荆素诱导RA大鼠的软骨细胞增殖 通过Western blot检测Ki67和PCNA蛋白表达，与Control组相比，Model组Ki67和PCNA蛋白表达显著下调(P<0.05，图2A)，说明牡荆素可抑制Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠细胞增殖；与Model组相比，给药组Ki67和PCNA蛋白表达显著上调(P<0.05，图2A)，且效果呈剂量依赖性增强，说明牡荆素呈剂量依赖性诱导RA大鼠的细胞增殖。

2.3牡荆素抑制RA大鼠的软骨细胞凋亡 Western blot检测Caspase-3和Caspase-9蛋白表达，与Control组相比，Model组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著上调(P<0.05，图2B)，与Model组相比，给药组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著下调(P<0.05，图2B)，且效果随给药剂量增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的细胞凋亡。

2.4牡荆素减轻RA大鼠炎症 ELISA检测大鼠外周血IL-17和IL-23含量，与Control组相比，Model组IL-17和IL-23含量显著升高(P<0.05，图3A)，说明牡荆素可抑制RA大鼠的炎症反应；与Model组相比，给药组IL-17和IL-23含量显著降低(P<0.05，图3A)，且效果随给药剂量增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的炎症反应。

图1 HE染色(×400)Fig.1 HE staining (×400)

流式细胞术检测CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平，与Control组相比，Model组CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比显著升高(P<0.05， 图3B)，说明牡荆素可抑制Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠的炎症反应；与Model组相比，给药组CD4+IL-17+和CD4+IL-23+百分比显著降低(P<0.05，图3B)，且效果随给药剂量的增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的炎症反应。

图2 Western blot检测Ki67、PCNA、Caspase-3和Caspase-9表达水平Fig.2 Expression levels of Ki67,PCNA,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

图3 各组大鼠IL-17、IL-23、CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平Fig.3 IL-17,IL-23,CD4+IL-17+and CD4+IL-23+ levels in each group of ratsNote: A.IL-17 and IL-23 levels were detected by ELISA;B.CD4+IL-17+and CD4+IL-23+levels were detected by flow cytometry.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

2.5牡荆素抑制RA大鼠MMP mRNA相关的表达 RT-PCR检测大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表达，与Control组相比，Model组MMP-1、MMP-3和MMP-13相关mRNA表达显著上调(P<0.05，图4A)，说明牡荆素可抑制Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA能诱导大鼠MMP相关RNA表达；与Model组相比，给药组MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表达显著下调(P<0.05，图4A)，且效果随给药剂量增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的MMP相关mRNA表达。

Western blot检测MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达，与Control组相比，Model组MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达显著上调(P<0.05，图4B)，说明牡荆素可抑制Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠MMP相关蛋白表达；与Model组相比，给药组MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达显著下调(P<0.05，图4B)，且效果随给药剂量增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的MMP相关蛋白表达。

2.6牡荆素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路 Western blot检测TGF-β1和p-Smad2蛋白表达,与Control组相比，Model组TGF-β1和p-Smad2蛋白表达显著上调(P<0.05)，说明牡荆素可抑制Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠TGF-β1/Smad2通路激活；与Model组相比，给药组TGF-β1和p-Smad2蛋白表达显著下调(P<0.05)，且效果随给药剂量增加而增强，说明牡荆素呈剂量依赖性抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路激活。见图5。

图4 各组大鼠的MMP-1、MMP-3和MMP-13表达水平Fig.4 MMP-1,MMP-3 and MMP-13 expression levels in each group of ratsNote: A.RT-PCR was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13 rekatuve mRNA;B.Western blot was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

图5 Western blot检测TGF-β1和p-Smad2蛋白表达Fig.5 Detection of TGF-β1 and p-Smad2 protein expression by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

3 讨论

RA发病可能与遗传、感染和性激素等有关，病理主要是滑膜衬里细胞增生、间质大量炎症细胞浸润及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等[12]。本研究通过HE染色发现RA大鼠的关节间隙狭窄、炎症细胞浸润，并伴有血管翳形成；而给药组大鼠病理症状明显减轻，这说明牡荆素能够减轻Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠的软骨损伤。

RA通常会抑制软骨细胞的增殖、诱导软骨细胞的凋亡，从而使软骨组织破坏，因此，有效抑制软骨组织破坏可减轻RA。Che等[7]报道牡荆素抑制心肌细胞凋亡对心脏起保护作用，因此，牡荆素有望抑制软骨组织破坏从而减轻RA。本研究发现牡荆素可显著上调RA大鼠的Ki67和PCNA表达，显著下调Caspase-3和Caspase-9表达，说明牡荆素诱导RA大鼠的软骨细胞增殖、抑制RA大鼠的软骨细胞凋亡。

RA通常存在间质大量炎症细胞浸润，因此，有效抑制炎症反应可减轻RA。Sun等[13]发现牡荆素通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡来减轻大鼠急性阿霉素的心脏毒性，因此，牡荆素有望抑制炎症反应从而减轻RA。本研究发现牡荆素可显著降低RA大鼠的IL-17和IL-23含量，说明牡荆素抑制RA大鼠的炎症反应。

CD4+T 淋巴细胞亚群平衡紊乱在RA关节局部的炎症发展和全身免疫反应过程中发挥重要作用。Canete等[14]发现RA滑膜淋巴细胞因子Th17/23的高表达和较高的疾病活性有关。Th17/23高表达除了能增强炎症反应外，还增强了关节胶原破坏、重建、使骨质破坏，及软骨破坏，并在急性滑膜炎转变为慢性破坏性关节炎中起关键作用[15]。本研究发现牡荆素显著降低RA大鼠CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比，说明牡荆素能抑制大鼠RA。

MMPs在正常的滑膜成纤维细胞和软骨细胞中无活性，而在RA患者滑膜液中高表达[16，17]，Okada等[18]研究发现活性MMPs具有使几乎所有软骨成分(蛋白聚糖、层黏连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白Ⅳ)变性的能力。因此，有效抑制MMPs表达能够减轻RA症状。本研究发现牡荆素显著下调RA大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达，说明牡荆素抑制RA大鼠的MMPs相关蛋白表达。

TGF-β/Smad信号通路在细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、黏附及胞外基质的产生中具有非重要的作用，其信号转导的异常与多种疾病的发生发展息息相关[19，20]。Hase等[21]研究发现通过下调TGF-β/Smad2信号通路抑制OPG的产生有助于RA的治疗，Xiong等[22]报道miR-21通过TGF-β/Smad信号通路减轻RA，证明TGF-β/Smad信号通路在RA的治疗中起重要作用。本研究发现牡荆素显著下调TGF-β1和p-Smad2蛋白表达，说明牡荆素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2信号通路。

综上所述，牡荆素能够减轻RA大鼠的软骨组织损伤、诱导软骨细胞增殖、抑制软骨细胞的凋亡和炎症反应，并显著下调血浆Th17、Th23和MMPs蛋白表达，从而对RA起缓解作用。这为牡荆素开发利用提供新的参考依据，为RA的预防和治疗奠定理论基础。