发酵冬虫夏草菌粉中虫草多糖的含量测定及其抗辐射作用初探※

杨建鑫，年永琼，段雅彬，辛元尧，朱 琳，刘贵琴，李向阳，5*

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海民族大学，青海 西宁 810007；3.重庆市药物种植研究所，重庆 408435；4.青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016；5.三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要产自青藏高原，活性成分包括虫草素、虫草多糖、虫草酸、甾醇以及脂肪酸和氨基酸等。国内外对冬虫夏草药理作用的研究主要集中在其抗肿瘤和免疫调节作用等方面，对其抗辐射作用的报道较少，其中有研究显示发酵冬虫夏草菌丝体能够显著提高致死剂量辐射后小鼠的存活率，加速白细胞恢复并刺激免疫淋巴细胞增殖[1]。虫草多糖是从虫草子实体、菌丝体及发酵液中提取分离得到的一种真菌多糖，为冬虫夏草的主要活性成分之一，具有抗氧化、保护造血系统及免疫调节作用。近年来，由于人类过度采挖造成天然冬虫夏草资源严重匮乏，目前虫草多糖的来源主要依赖于发酵培养的菌丝体和发酵液。有研究显示虫草多糖对紫外线B辐射诱导的人体皮肤细胞DNA损伤有保护作用[2]。Zhang等[3]研究发现，虫草多糖可通过减少氧化损伤和调节细胞因子IL-4、IL-5和IL-17的分泌，增强60Coγ射线辐射小鼠的免疫活性。本研究通过测定发酵冬虫夏草菌粉中多糖的含量，观察存活率，检测外周血象，计算胸腺及脾脏的脏器指数，测定骨髓DNA含量探讨虫草多糖的抗辐射作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

发酵冬虫夏草菌粉(FermentedCordycepssinensispowder。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体，批号：ZF0418F002)购自青海珠峰冬虫夏草保健品有限公司；虫草多糖(Cordycepssinensispolysaccharides，CSP。批号：C03A9Y57641，含量88.09%)购自上海源叶生物科技有限公司；氨磷汀(批号：J0311A)购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 实验仪器

23EX医用电子直线加速器购自美国VaRian公司；Sysmex XN-10(B1)全自动模块式血液体液分析仪购自日本希森美康株式会社；TU-1810紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52型旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；BT224S电子分析天平购自德国赛多利斯科学仪器公司；TGL-16gR高速冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠(6～8 w，18～22 g)购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2017-003。分笼饲养(日光光照明暗交替，自由饮食饮水)于青海大学医学院实验动物中心。适应性喂养1 w后进行实验。

1.4 分组与给药方法

将小鼠随机分为6组：正常对照组，辐射模型组，阳性对照组(氨磷汀，150mg/kg)，虫草多糖低剂量组(100mg/kg)、虫草多糖中剂量组(200mg/kg)、虫草多糖高剂量组(400mg/kg)。虫草多糖各组每日以灌胃方式予相应剂量(20mL/kg)药物，正常对照组、辐射模型组以灌胃方式予等体积生理盐水(0.3mL)，连续14 d后进行照射，阳性对照组于照射前30 min于腹腔注射氨磷汀溶液。

1.5 虫草多糖含量测定方法

1.5.1 供试品溶液

精密称取1.0 g干燥的发酵冬虫夏草菌粉，按料液比1：20(g/mL)加入20 mL水，溶解1 h后，水浴(90℃)浸提110 min，浸提3次，真空过滤后合并提取液并浓缩至1/3体积。随后在浓缩液中加入3倍体积无水乙醇，剧烈搅拌，静置过夜(4℃)。离心(8000g)30 min，弃去上清液，将沉淀物干燥(65℃)至恒重。加水溶解并定容至50 mL，而后取1 mL加水定容至25 mL，作为供试品溶液备用。

1.5.2 对照品溶液

精密称定0.010 g葡萄糖，加水溶解定容至100 mL配制成100 mg/L的葡萄糖溶液，作为对照品溶液备用。

1.5.3 线性关系

精密量取对照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，用水补足至每管2 mL，缓慢加入7.0 mL 98%的浓硫酸，摇匀，恒温放置1 h，加入1.0 mL 4%的苯酚溶液，摇匀，水浴(40℃)35 min后行冰水浴5 min，取出放置20 min，使用紫外-可见分光光度计全波段扫描，确定最大吸收波长，而后在最大吸收波长处测定吸光度。以葡萄糖质量为横坐标、吸光度为纵坐标，进行线性回归分析。

1.5.4 精密度

精密量取供试品溶液1.0 mL，加入1.0 mL水，按1.5.3项下所示最佳条件显色并测定吸光度，平行测定6次，计算RSD值。

1.5.5 稳定性

精密量取供试品溶液1.0 mL，加入1.0 mL水，按1.5.3项下所示最佳条件显色并测定吸光度，每10 min测定一次，连续测定2 h，计算RSD值。

1.5.6 重复性

精密量取6份供试品溶液，按1.5.3项下所示最佳条件显色并测定吸光度，计算RSD值。

1.5.7 加样回收率

精密量取供试品溶液0.5 mL置于10 mL具塞试管中，分别精密加入葡萄糖对照品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，用水补足至每管2 mL，按1.5.3项下所示最佳条件显色并测定吸光度，计算加样回收率。

1.5.8 样品含量

取6份供试品溶液，按1.5.3项下所示最佳条件显色并测定吸光度，计算RSD值。样品中多糖含量以质量分数ω计，单位以百分比表示，按如下公式计算：

m1：从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为μg；V1：样品定容体积，单位为mL；m2：样品质量，单位为g；V2：比色测定时所移取样品测定液的容积，单位为mL；0.9：葡萄糖换算葡聚糖的校正系数。

1.6 存活率测定方法

按1.4项下所示方法分组并给药，每组10只小鼠，除正常对照组外其余各组小鼠采用医用电子直线加速器X射线予全身一次性照射(TBI)，照射剂量12 Gy(吸收剂量率300cGy/min，时间240s，视野40×40cm，源皮距100cm)。照后连续观察30 d小鼠的生存状态。

1.7 指标测定方法

按1.4项下所示方法分组并给药，每组10只小鼠，除正常对照组外其余各组小鼠的照射剂量为5 Gy TBI(吸收剂量率300cGy/min，时间100s，视野40×40cm，源皮距100cm)。

1.7.1 外周血象

各组小鼠在照射后第1、3、5 d时从眼底静脉丛取血20 μL置含有EDTA-2Na的抗凝管中，取全血用血细胞分析仪在预稀释模式下检测外周血象。

1.7.2 脏器指数

于照后第5 d时取各组小鼠胸腺、脾脏，除去血渍，用滤纸吸干后称重，计算相应脏器指数(%)：[脏器质量(g)/动物体重(g)]×100%。

1.7.3 骨髓DNA含量的测定

于照后第5 d时取各组小鼠右侧股骨，剥离肌肉组织后剪断第二股骨，用10 mL CaCl2(0.005mol/L)溶液将骨髓冲入离心管中，重复冲洗多次后将骨髓液放置(4℃)30 min，随后离心(2500r/min)15 min，弃上清液取沉淀物加入5 mL HClO4(0.2mol/L)酸化，充分混匀后水浴(90℃)加热15 min，用流水冷却、滤纸过滤，滤液用紫外-可见分光光度计在260 nm处测定吸光度(A值)，以该值确定骨髓DNA含量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 发酵冬虫夏草菌粉中多糖的含量测定

2.1.1 线性关系考察

利用紫外-可见分光光度计对供试品溶液进行全波段(200～800nm)扫描，最终确定最大吸收波长为480 nm，因此在480 nm处测定吸光度。以葡萄糖质量为横坐标、吸光度为纵坐标，进行线性回归。得到回归方程为Y=0.0076X+0.0165，线性范围为10～100 μg，相关系数r=0.999(P<0.05)，表明葡萄糖在10～100 μg范围内线性关系良好。标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

Figure 1 Standard curve of glucose

2.1.2 精密度

精密量取供试品溶液在最佳显色条件下平行测定6次后，测得吸光度为0.113±0.002，RSD值为1.58%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性

精密量取供试品溶液，在最佳显色条件下每10 min测定一次吸光度，连续测定2 h，测得吸光度为0.110±0.001，RSD值为1.20%，表明在10～120 min内供试品溶液稳定性良好。

2.1.4 重复性

精密量取6份供试品溶液后，在最佳显色条件下测得吸光度为0.108±0.001，RSD值为1.31%，表明重复性良好。

2.1.5 加样回收率

精密量取供试品溶液在最佳显色条件下测得结果见表1，平均回收率为97.72%，RSD值为2.53%，表明回收率满足要求。

表1 加样回收率试验结果

Table 1 Results of recovery test

2.1.6 样品的含量

精密量取6份供试品溶液在最佳显色条件下测定吸光度后，最终计算得到样品中多糖的平均含量为1.35%。

2.2 虫草多糖对辐射损伤小鼠存活率的影响

实验结果显示，辐射组小鼠经X射线照射后饮食减少、体重减轻、皮毛光泽减退、行动迟缓且精神萎靡；虫草多糖处理各组小鼠照射后体征有所改善，30 d内存活率和存活时间也明显提高。与正常组相比，辐射组小鼠存活率显著下降(P<0.05)；与辐射组相比，虫草多糖中剂量组存活率有明显提高(P<0.05)，见表2、图2。

表2 虫草多糖对辐射损伤小鼠存活率的影响值(%)

Table 2 Effect of CSP on survival rate in radiation-injured mice(%)

图2 虫草多糖对辐射损伤小鼠存活率的影响图

Figure 2 Effect of CSP on survival rate in radiation-injured mice

2.3 虫草多糖对辐射损伤小鼠指标的影响

2.3.1 虫草多糖对辐射损伤小鼠外周血象的影响

与正常组比较，辐射组小鼠WBC、RBC及HGB数目均有所下降，而PLT数目在照射后升高，其中WBC数目在照射后第1、3、5 d时显著降低了72.03%、85.31%、88.81%(P<0.05)，PLT数目在照射后第3 d时显著升高了28.24%(P<0.05)；与辐射组比较，虫草多糖中剂量组在照射后第3 d时 WBC显著升高了59.65%(P<0.05)，虫草多糖低剂量组在照后第3、5 d时 PLT显著降低了22.84%、24.43%(P< 0.05)，见表3～5。

组别nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常对照组102.86±0.4511.28±0.25173.33±4.26386.67±58.50辐射模型组100.80±0.09#10.24±1.14151.33±15.76480.67±70.01阳性对照组100.81±0.0410.79±0.16169.83±3.20438.67±86.99CSP低剂量组100.88±0.1011.38±0.30170.00±5.07580.00±45.04CSP中剂量组100.86±0.0411.91±0.35187.33±5.18519.67±71.13CSP高剂量组100.88±0.0411.80±0.32175.00±4.14519.83±19.42F- 18.305 1.407 2.345 1.194P- <0.001 0.250 0.065 0.336

#：与正常对照组比较，P<0.05

组别nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常对照组103.88±0.2611.69±0.78171.75±11.76777.62±64.28辐射模型组100.57±0.07#11.76±0.56174.75±8.52997.25±72.67#阳性对照组100.59±0.0611.18±0.72168.25±10.41791.75±61.88∗CSP低剂量组100.45±0.0310.60±0.54158.38±8.72769.50±59.84∗CSP中剂量组100.91±0.06∗12.96±0.80190.12±9.53907.75±85.00CSP高剂量组100.54±0.0412.59±0.53188.62±7.71885.12±68.68F- 129.968 1.715 1.642 1.720P- <0.001 0.150 0.170 0.151

#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与辐射模型组比较，P<0.05

组别nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常对照组104.11±0.227.01±0.27104.25±4.08722.50±32.91辐射模型组100.46±0.08#6.19±0.4891.13±6.71885.75±75.79阳性对照组100.68±0.065.94±0.3091.00±4.28567.00±85.49∗CSP低剂量组100.61±0.076.39±0.3597.25±5.28669.38±38.59∗CSP中剂量组100.54±0.075.79±0.5485.75±7.80871.00±56.67CSP高剂量组100.35±0.036.34±0.4097.63±6.22684.75±110.38F-196.384 1.129 1.230 2.956P-<0.001 0.360 0.312 0.022

#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与辐射模型组比较，P<0.05

2.3.2 虫草多糖对辐射损伤小鼠脏器指数及骨髓DNA含量的影响

与正常组比较，辐射组小鼠胸腺、脾脏指数及骨髓DNA的含量均显著降低了47.68%、58.90%、63.86%(P<0.05)；与辐射组比较，虫草多糖各组胸腺及脾脏指数均有所升高，中剂量组对脾脏及胸腺的改善结果较好，分别升高了69.62%、30.00%(P<0.05)，而骨髓DNA含量均有上升趋势，但无统计学意义，见表6。

组别n胸腺指数(%)脾脏指数(%)骨髓DNA(A)正常对照组100.151±0.0070.219±0.0120.570±0.034辐射模型组100.079±0.012#0.090±0.003#0.206±0.012#阳性对照组100.070±0.0040.098±0.0050.283±0.023∗CSP低剂量组100.080±0.0070.108±0.0030.220±0.015CSP中剂量组100.134±0.006∗0.117±0.008∗0.217±0.015CSP高剂量组100.125±0.0140.101±0.0050.211±0.043F- 14.509 48.381 29.593P- <0.001 <0.001 <0.001

#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与辐射模型组比较，P<0.05

3 讨论

本实验测得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体中多糖含量为1.35%。以往研究发现发酵冬虫夏草菌粉中多糖的平均含量为3.848%，天然冬虫夏草中多糖的含量为2.24%～3.59%[4]，本实验测得发酵冬虫夏草菌粉中多糖的含量低于文献报道，我们推测可能与提取时间及提取条件有关，因此今后应进一步优化虫草多糖的提取条件，以提高提取率及纯度。

电离辐射可显著影响机体的造血、免疫、神经、内分泌等系统，对造血系统的影响主要表现在对骨髓造血干细胞、造血基质细胞的抑制和破坏，以及对外周血细胞的影响等；对免疫系统的影响主要表现为免疫活性淋巴细胞数量减少、细胞因子网络调节失常、抗体形成抑制，最终导致免疫功能障碍和低下，引发一系列并发症[5]。在临床上，约50%的深部肿瘤需要用6 MV或以上的高能X射线进行放射治疗，但放疗引起的损伤严重影响其疗效及患者的生存质量。

研究发现在照射剂量较低的全身一次性照射下，冬虫夏草热水提取物可保护小鼠因辐射所致的骨髓型死亡，而这一作用主要是通过加速白细胞数目的恢复而实现的[6]。本文结果同样表明5 Gy X射线全身一次性照射可使小鼠WBC数目明显下降，且随照射后天数增加WBC数目的下降幅度增高，而虫草多糖可在一定程度上提高WBC的数目。另有研究显示机体在照射后，WBC、HGB数目会出现下降，但这种下降往往发生在照后较长的一段时间内，而PLT数目变化则不明显[7]。临床研究同样表明长期低剂量电离辐射会显著增加外周白细胞的异常检出率，而对血红蛋白和血小板没有显著的影响[8]。这与本研究结果基本一致，在照射后第1、3、5天辐射组小鼠RBC、HGB以及PLT数目变化均不明显。

研究表明，不同剂量的虫草多糖能逆转环磷酰胺诱导的小鼠免疫器官萎缩，增强机体特异性体液免疫功能[9]。本研究结果显示不同剂量的虫草多糖对辐射损伤小鼠的胸腺及脾脏重量均有一定的增加作用，其中中剂量组能显著提高两种免疫器官的脏器指数。另外，辐射对机体造成的DNA损伤如本结果所示是较为严重的，但虫草多糖对修复骨髓DNA损伤效果不明显。

基于对虫草多糖影响辐射损伤小鼠造血、免疫系统的研究，我们可以得出虫草多糖可能是通过提高机体免疫达到对电离辐射的防护作用。存活率实验表明，小鼠在全身一次性照射(12Gy)下第5天开始出现死亡，而阳性组及虫草多糖组能提高辐射损伤小鼠的存活率和存活时间，且结果显示虫草多糖组的防护效果优于阳性药物组，尤以中剂量组最佳，这与脏器指数、外周血象结果一致。