银耳菌丝体多糖理化性质及其吸湿保湿性能测定

方园园， 邓校娟， 张 俊， 胡伟东， 孙玉军

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

银耳(Tremellafuciformis)又名白木耳,是一种重要的食药用真菌[1],人们食用的银耳为银耳的子实体,素有“菌中之冠”的美称,具有补脾开胃、益气清肠、滋阴、润肤之功效。长期食用银耳子实体,可提高机体免疫力。

银耳子实体富含银耳多糖,是其主要的活性成分,具有免疫调节[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒[5]等多种功能。据报道,银耳多糖还具有在化妆品方面的应用潜能。通过在化妆品中添加不同比例的银耳子实体多糖,其保湿效果良好;经护肤功效检测具有优良的保湿功效, 能够降低皮肤粗糙度, 增加皮肤弹性, 可作为护肤品的功效成分[6-7]。银耳子实体多糖还具有一定的清除氧自由基等抗氧化能力, 可作为护肤品中的抗衰老因子防治皮肤老化[8]。但关于银耳菌丝体多糖在护肤品中的应用研究鲜有报道。本研究拟从银耳菌种出发,通过液态发酵制备菌丝体,从中提取银耳菌丝体多糖,测定其部分理化性质及吸湿保湿性能,为银耳菌丝体资源的开发及银耳菌丝体多糖的护肤功效应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料、仪器与试剂

菌种:银耳(Tremellafuciformis):CGMCC 5.466,购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。L550 离心机(湖南湘仪试验室仪器开发有限公司);R-1001VN旋转蒸发仪器(郑州长城科工贸有限公司);FD-1A-50 冷冻干燥机(北京博医康试验仪器有限公司);U-T6PC紫外可见分光光度计(上海屹谱仪器制造有限公司);PE 1730 红外光谱仪(美国Peakin Elmer公司);EVO 18扫描电子显微电镜(德国Carl Zeiss公司);Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent 1260蒸发光散射检测器(美国Agilent公司)。

葡萄糖(Glc),木糖(Xyl),半乳糖(Gal),甘露糖(Man),阿拉伯糖(Ara),鼠李糖(Rha)，葡萄糖醛酸(GlcA)，半乳糖醛酸(GalA)，岩藻糖(Fuc)等标准单糖(德国Merk公司);其余试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 银耳菌丝体的发酵培养及其多糖(PMT)的制备 将银耳菌种先活化,再制备种子液,按5%的接种量接种于250 mL锥形瓶中,25 ℃,转速150 r/min,摇床发酵培养4 d,滤布过滤得菌丝体,分别经自来水和蒸馏水淋洗,拧干,冷冻干燥,粉碎,过100目筛,得银耳菌丝体粉末[9]。

称取银耳菌丝体粉末,按1∶20(g∶mL)加入蒸馏水,于85 ℃恒温水浴锅中浸提2 h,离心,留上清液,滤渣按上述操作再浸提1次,合并2次上清液,旋转蒸发(65 ℃,60 r/min)浓缩至适当体积,离心(4 800 r/min) 10 min,上清液加4倍无水乙醇沉淀24 h,离心(4 800 r/min)15 min,回收上清液乙醇,蒸馏水充分溶解沉淀,Sevag法脱蛋白,脱蛋白液再旋转蒸发(65 ℃,80 r/min)浓缩至适当体积,透析袋(截留分子量3 KD)透析48 h,冷冻干燥得银耳菌丝体多糖。

1.2.2 PMT的一般性质测定 molish反应;I2-KI反应;斐林试剂反应;水溶性、醇溶性测定[10]。

1.2.3 PMT的总糖含量测定 总糖含量测定采用硫酸-苯酚法[11],以葡萄糖为标准品。

1.2.4 PMT的红外光谱扫描 取PMT 2 mg,与KBr粉末混匀,压片,红外光谱仪于400～4 000 cm-1波数范围内扫描,观察吸收峰情况,并对图谱及谱峰归属情况进行分析。

1.2.5 PMT的扫描电镜观察 选取适量PMT于载物台上,喷金后观察其多糖表面形貌特征[12]。

1.2.6 PMT的单糖组分测定 取40 mg PMT、4 mL 1 mol/L H2SO4溶液于试管中,酒精喷灯封管,105 ℃水解8 h,BaCO3中和过量的H2SO4,4 500 r/min离心10 min,取上清得PMT单糖水解样品,同时取系列标准单糖(Glc、Gal、Man、Xyl、Ara、Rha 、GlcA、GalA、Fuc),进行ELSD-HPLC 测定分析[13]。

1.2.7 PMT的吸湿性质测定 称取2组0.5 g PMT、海藻酸钠、甘油各3份于称量瓶中,一组置于装有饱和Na2CO3溶液(RH 43%)的干燥器中,另一组置于饱和(NH4)2SO4溶液(RH 81%) 的干燥器中,室温放置,并分别于3、6、9、12、15、18、21、24 h 时测定样品质量,计算3次平均值,按下式计算吸湿率[14]:

式中:Mn为不同时间样品质量(单位:g);Mo为样品初始质量(单位:g)

1.2.8 PMT的保湿性质测定 称取0.5 g PMT、海藻酸钠、甘油各3份于称量瓶中,加入0.2 g 的蒸馏水,待样品充分吸水后,置于装有硅胶的干燥器内,室温放置,并分别于3、6、9、12、15、18、21、24 h 后称重,计算3次平均值,按下式计算保湿率[15]:

式中:Hn为不同时间样品水分质量(单位:g);Ho为样品初始水分质量(单位:g)

2 结果与分析

2.1 PMT的一般理化性质

银耳菌种经液体发酵获得菌丝体,采用温水浸提、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、透析、冷冻干燥等步骤制备PMT。

溶解度方面PMT易溶于水,但不溶于高浓度的乙醇,其水溶液透明且具有一定粘稠性,涂于皮肤,湿润时肤感很好;与molish反应呈现紫红色,表明PMT为糖类物质;与I2-KI反应,呈阴性,不显蓝色,表明PMT为非淀粉类物质;与斐林试剂反应不显砖红色,表明PMT为非小分子还原糖,以上结果综合表明PMT为一种非淀粉类多糖。

2.2 PMT的总糖含量

以葡萄糖为标准品,采用硫酸-苯酚法测定,得到总糖的标准曲线回归方程为y=0.015x-0.188 2,R2=0.997 5,根据回归方程,计算得到PMT的总糖含量为81.52%。

2.3 PMT的红外光谱

PMT的400～4 000 cm-1波数范围内红外光谱见图1。由图1可知,PMT的主要谱峰归属为3 337、2 934、1 655、1 552、1 405、1 079、1 048、815 cm-1,其中3 337 cm-1吸收峰是由糖类O-H伸缩振动引起的,2 934 cm-1是糖类的特征吸收峰,1 655、1 552 cm-1吸收峰是糖类C=O非对称伸缩振动引起的,1 405、1 079、1 048 cm-1吸收峰是由糖类C-O伸缩振动引起的,815 cm-1是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。因此PMT是一种含有α-D-半乳吡喃糖的多糖。

图1 PMT的红外光谱

2.4 PMT的扫描电镜图谱

图2 PMT的1 000×(A)和5 000×(B)扫描电镜图谱

由图2可知,PMT表面不光滑,有许多呈花菜状凸起,大小不一,但形状相似且较为规则,大量凸起的存在,增加了PMT的表面积,暴露出更多的羟基,通过氢键与水分子相连接,增加其水溶性、吸湿性与保湿性能。

2.5 PMT的单糖组分分析

注:*-溶剂峰, 1-Man, 2-GlcA, 3-GalA, 4-Rha, 5-Glc, 6-Gal, 7-Ara, 8-Fuc, 9-Xyl

标准单糖(A)及PMT水解样品(B)的ELSD-HPLC图谱见图3。以标准单糖为参照,根据保留时间可判断PMT单糖组分有甘露糖、葡萄糖、半乳糖等,再根据峰面积大小,计算PMT单糖组分的摩尔比为Man∶Glc∶Gal=5.25∶2.82∶1,这与马素云等[16]报道的结果有差异,究其原因前者是菌丝体多糖,后者是子实体多糖,另外银耳的菌种来源也不同。

2.6 PMT的吸湿性能

图4 不同样品在相对湿度43%环境(A)、81%环境(B)的吸湿率

PMT等样品的吸湿效果见图4。由图4(A)可知,在相对湿度RH 43%的环境中,PMT、海藻酸钠、甘油的吸湿率均随着时间的延长,呈上升趋势。在3～12 h范围内,甘油和PMT 的吸湿程度上升较快,而后上升趋于平缓,而海藻酸钠在3～24 h范围内吸湿均较为缓慢。三者相比较,吸湿率大小依次为:甘油>PMT>海藻酸钠。甘油、PMT和海藻酸钠等3种物质均含有羟基,单位质量内甘油含有的羟基数目要比PMT和海藻酸钠高,因此吸湿率最高;海藻酸钠为一种从海洋生物中提取的多糖,一般含杂质较多,因此其吸湿率低于银耳菌丝体多糖PMT。由图4(B)可知,在相对湿度RH 81%的环境中,PMT、海藻酸钠、甘油的吸湿率也随着时间的延长,呈上升趋势。在3～12 h范围内,甘油和PMT 的吸湿程度同样上升较快,而后上升趋于平缓,而海藻酸钠在3～24 h范围内吸湿均较为缓慢。三者相比较,吸湿率大小依次为:甘油>PMT>海藻酸钠。在同一时间里,环境的相对湿度越大,样品的吸湿率越高。

2.7 PMT的保湿性能

图5 不同样品在干燥硅胶环境中的保湿率

PMT等样品的保湿效果见图5。由图5可知,在干燥的环境中,随着时间的延长,PMT、海藻酸钠和甘油的保湿率也随之下降。三者相比较,甘油的保湿率下降最快,保湿率由高到低的顺序为:PMT>海藻酸钠>甘油。海藻酸钠具有很强的凝胶化性能,易形成水凝胶,保水能力强;PMT具有一定的粘稠性,具有成膜特性,易锁住水份,因此保湿效果均高于甘油。

3 结论与讨论

PMT为一种从银耳菌丝体中提取得到的由甘露糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成的吡喃型多糖,水溶性好,难溶于高浓度乙醇,其总糖含量为81.52%,其表面粗糙,有许多呈花菜状凸起,具有较好的吸湿、保湿性能。

保湿因子是护肤品中保障皮肤滋润柔嫩的重要成分,甘油是目前常用的合成保湿物质,其吸湿性能显著,能从空气中吸附水分子,为皮肤提供水分,但保湿性能一般,作为保湿因子还存在美中不足,而广泛存在于自然界中的天然保湿物质——多糖具有较好的吸湿与保湿双重功能, 符合保湿因子的发展方向,也满足人们对于纯天然物质成分的追求。另外多糖还具有抗氧化、抗衰防老、抑菌等多种功效,因此作为保湿因子添加到护肤品中具有功效广泛、安全性高等优点,含有天然多糖的护肤品现成为人们追求美和健康的一种时尚。

PMT作为一种天然多糖,具有较强的吸湿保湿性能,可作为一种天然的保湿因子应用于护肤品中,具有很大的潜力。另外PMT的制备材料银耳菌丝体为银耳菌种液体发酵所得,可通过发酵罐液体发酵大量生产,且发酵条件可人工控制,能保证原料的大量供应和一致性,能够避免银耳子实体的来源受菌种、种植条件等因素影响的局限性。关于PMT能否清除氧自由基、抑制酪氨酸酶等抗衰老与美白功能有待进一步研究。

综上所述,PMT提取总糖含量为81.52%,具有典型的多糖吸收峰,其单糖组成为Man∶Glc∶Gal=5.25∶2.82∶1.00,其表面不光滑,有许多呈花菜状凸起。在相对湿度43%、81%情况下,样品的吸湿率大小顺序为甘油>PMT>海藻酸钠。在干燥环境下,样品的保湿率大小顺序为PMT>海藻酸钠>甘油。表明PMT具有一定的吸湿保湿性能,可作为保湿因子在护肤品中具有一定的开发应用潜力。