常压室温等离子体(ARTP)对灵芝菌丝体的影响

韦 达， 黄 青， 何华奇

(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.中国科学院 合肥物质科学研究院，安徽 合肥 230031)

灵芝(Ganodermalingzhi)在真菌分类上属于担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属真菌[1-2]。早在两千多年前，就将其作为上品滋补药材应用于治病保健，由于灵芝具有特殊的药用价值，其有效成分的分析及药理作用研究己引起了国际上的关注[3]。目前，对灵芝的研究己逐渐深入到分子水平，这些研究在灵芝保健功能、抗衰老机理和防癌抗癌研究试验方面成绩显著[4-6]。其中灵芝多糖是灵芝主要有效成分之一，研究表明灵芝多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基等具有清除能力，具有抗氧化的作用[7]。多糖能提高抗体生成从而调节体液免疫和促进产生免疫细胞因子的作用[8-9]。灵芝多糖能激活宿主细胞的免疫调节，也被用于临床抗肿瘤治疗[10]。

常压室温等离子体(atmospheric room-temperature plasma，ARTP)，具有自身作用时间短、无污染等特点，在诱变、灭菌等领域发挥着重要作用[11]。ARTP中包含着大量的活性物质(如自由电子、中性粒子、超氧化物、过氧化物、羟基自由基等)，这些活性物质对生物体会产生影响，可以促进其生长代谢，导致生理活性发生变化[12]。刘京华等[13]利用介质阻挡放电诱变雨生红球藻获得虾青素积累量较高的新品系，王纯阳等[14]利用低温低气压等离子体处理水稻种子，研究发现等离子体在一定条件下能够提高水稻种子生长活力。骆美洁等[15]利用ARTP处理玉米种子以及花粉,处理30 min幼苗显著增长，同时促进了幼苗干物质积累增加了干重。蒋佳峰等[16]用低温等离子体处理小麦种子，结果表明低温等离子体处理能促进小麦生长，提高小麦产量。

本研究利用等离子体处理灵芝菌丝体，探讨等离子体对灵芝菌丝生长速度、生物量和灵芝多糖含量的影响，为提高灵芝菌丝体产量以及品质提升提供新途径和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

赤芝菌种，由中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所保藏，提供并鉴定。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，称取46 g PDA培养基加水至1 L，121 ℃高压灭菌30 min，倒入平板冷却,放入37 ℃培养箱中24～48 h，检查是否灭菌完全。

PDB培养基：土豆粉15 g/L煮熟双层纱布过滤、MgSO40.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、葡萄糖20 g/L、pH自然。121 ℃高压灭菌30 min，冷却待用。

PDA 蒽酮、硫酸、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4等试剂均为国产分析纯，购于国药试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 在超净工作台中，将灵芝菌种接种若干PDA培养基，置于28 ℃培养箱中，待菌丝长满备用。

1.2.2 培养灵芝菌丝体 无菌条件下，将平板中的菌块接至灭菌后的液体培养基中，于28 ℃，180 rpm/min转速摇床震荡培养7 d，得到灵芝菌丝体。

1.2.3 ARTP处理 本实验在中科院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所完成，ARTP采用介质阻挡放电等离子体(dielectric barrier discharge plasma，DBDP)，等离子体发生装置见图1。无菌条件下，从长满菌丝的 PDA 斜面中取5 mm2大小菌块若干，分别置于φ=2 cm的石英等离子体反应皿中，将介质阻挡反应探棒置于菌块上方1 mm处，封闭反应体系，通入氦气4～6 min，气体流量2 L/min；电压为13 kV，放电时间0～4 min，对灵芝菌丝体进行处理[17]。每个处理设置3次重复。挑取液体培养的菌丝体，置于灭菌的匀浆器中，反复按压，制成菌丝匀浆。用移液枪吸取1 mL匀浆置于φ=2 cm 的石英等离子体反应皿中，ARTP条件同上。

图1 介质阻挡放电低温等离子体(DBD-LTP)实验装置示意图

1.3 测定项目

1.3.1 菌丝体生长速度的测定 无菌条件下，将处理后将菌块接种于PDA平板上，置于28 ℃生化培养箱进行培养，待菌丝生长，用记号笔画出菌落生长范围，用十字交叉法测量菌落直径[18]，计算菌丝生长速度(cm/d)，每株3 个重复。

1.3.2 菌丝体生物量的测定 无菌条件下，将处理后接种于PDB培养基中，等菌丝长满后用无菌水反复洗涤3次，冷冻干燥得到灵芝菌丝冻干粉，用分析天平测定菌丝体干重，每组设置3个重复。

1.3.3 灵芝多糖的测定 蒽酮-硫酸法测定灵芝多糖[19]：精密量取0.12 mg/mL葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于试管中，加水至2.0 mL。加入6 mL2.5 mg/mL的硫酸蒽酮溶液，摇匀，15 min后，冰浴15 min。于625 nm波长处测定吸光度，得回归方程Y=5.005X+0.234 9，R2=0.999 4,说明糖浓度在规定范围内线性良好。供试品溶液的制备：精确称定取菌丝冻干粉0.1 g，加水4 mL，静置1 h，80 ℃水浴3 h，3 500 rpm/min离心5 min，留上清液待测。精确量取供试品溶液2 mL，按照标准曲线操作方法，在625 nm波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 ARTP处理对灵芝菌丝生长速率的影响

ARTP处理对灵芝菌丝生长速率影响见图2所示。ARTP处理 0～2 min，菌丝生长速率高于对照组，其中处理0.5 min的菌丝生长最快，比对照组提高了9.96%。ARTP处理 3、4 min 生长速率低于对照组，表明等离子体处理既能促进菌丝生长，也能抑制菌丝生长，等离子体处理时间过长则不利于菌丝体的生长。

2.2 ARTP对菌丝体生物量的影响

等离子体处理，灵芝菌丝体生物量见图3所示，等离子体处理0～3 min，菌丝体干重比对照组均有所提高，其中处理1 min菌丝体干重最大，与对照组相比提高了25.03%。

图3 ARTP处理对灵芝菌丝体干重的影响

2.3 等离子体处理对灵芝多糖含量的影响

ARTP灵芝多糖含量见图4所示，ARTP 0～4 min，与对照组相比灵芝多糖含量均有所提高。其中ARTP 1 min，灵芝多糖含量最高，与对照组相比提高了44.66%。

图4 ARTP处理对灵芝菌丝体多糖的影响

3 结论与讨论

ARTP是一种应用广泛的菌种诱变方法。灵芝菌种经适当处理后，培养的菌丝体形态以及生长速率均会发生改变，表明等离子体处理可能引起灵芝菌种某些生物状态发生改变，而这一改变表明菌丝体所含的某些活性物质如多糖含量也会发生改变。等离子体处理时间不同，对菌丝体影响也不同，通过单因素试验，优化了等离子体处理时间。在设定的等离子体处理条件下，处理时间为1 min，生物量与对照组相比提高了25.03%，灵芝多糖含量与对照组相比提高了44.66%，有利于生物量积累以及灵芝多糖合成。

本研究考察了低温ARTP处理对灵芝菌丝体干重和灵芝多糖含量的影响，通过实验尝试，获得了一些提高生物量以及灵芝多糖含量的等离子体处理条件。结果表明，采用低温ARTP可以促进灵芝菌丝生长，增加菌丝体生物量、提高灵芝多糖含量，这是一种简单易行并且实用性强的方法，具有较好的应用前景。另外本研究只对等离子体处理对灵芝菌丝体多糖含量的影响进行考察，因而对灵芝菌丝体发酵过程中胞外多糖以及灵芝子实体多糖有待进一步研究。