酚反应鉴别籼粳稻类型的影响因素研究

周坤 李萍* 崔晶 李凤英 藤田明子 张欣 松江勇次

（1 天津农学院基础科学学院，天津 300384；2 天津农学院/天津市食味水稻科技创新与成果转化国际联合研究中心，天津300384；3 天津市金芦米业有限公司，天津 301500；4 日本株式会社佐竹公司，日本 广岛739-8602；5 九州大学全球创新中心，日本 福冈 812-8540；*通讯作者：liping790520@126.com）

我国栽培稻主要分为籼稻和粳稻两个亚种，它们在分布地域、形态特征和遗传特性上明显不同[1]。正确鉴定籼粳稻类型对于育种和生产十分必要，也是有效利用稻种资源的前提。关于籼粳稻类型的鉴定，文献报道的方法主要有程氏指数法[2]、同工酶基因数量化法[3-4]、分子标记法[5-7]、氯酸钾抗性法[8]、机动细胞硅酸体形态性状法[9]和双峰乳突法[10]。其中，程氏指数法是根据稻的6 项性状（稃毛、酚反应、穗轴第1～2 节长、抽穗时壳色、叶毛、籽粒长宽比）指标进行综合评分鉴定，准确度较高，被国内外研究者广泛采用[11-13]。

酚反应是程氏指数法中唯一一个化学性状指标，是指籼稻遇苯酚变成深浅程度不一的黑褐色，粳稻遇苯酚不变色。有研究表明，酚反应与程氏指数法的其他几项性状指标都呈显著相关性[14]，且由于酚反应仅需要用一定浓度的苯酚溶液浸泡供试材料，操作简便，颜色变化容易观察。因此，用酚反应初步快速鉴定籼粳稻类型具有实用价值。关于酚反应鉴别籼粳稻类型影响因素的详细研究仅有董克1 篇文献报道[15]，得到的结论是，不同酚浓度下谷粒染色程度差异不明显，浸泡温度对酚反应几乎没有影响。本文深入探讨影响酚反应的有关因素，为提高酚反应快速鉴定籼粳稻类型的可操作性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试水稻材料共19 个，包括10 个粳型常规稻、9个籼型常规稻。粳型常规稻分别由天津市原种场、黑龙江省农业科学院五常水稻研究所、江苏省农业科学院粮食作物研究所提供。籼型常规稻分别由江西省农业科学院水稻研究所、广东省农业科学院水稻研究所提供。

苯酚（分析纯）购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 试验设备

垄谷机（SY-88-TH 型），韩国双龙机械工业有限公司；碾米机（CBS 300AS 型），日本株式会社佐竹公司。

1.3 试验方法

将5 g 发育正常、无斑点试验材料置于直径为9 cm 的玻璃培养皿中，注入一定浓度的苯酚水溶液20 mL，迅速盖上培养皿盖，室温浸泡，定期观察试验材料的颜色变化。

1.4 影响酚反应的因素

1.4.1 浸泡时间对酚反应的影响

按1.3 的方法浸泡稻谷，苯酚水溶液浓度为1%，分别在 3 h、6 h、9 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 观察颜色并拍照，考查浸泡时间对酚反应的影响。

1.4.2 稻米形态对酚反应的影响

按1.3 的方法浸泡稻谷、糙米和精米，苯酚水溶液浓度为1%，浸泡72 h，观察颜色并拍照，考查稻米形态对酚反应的影响。

图1 浸泡时间对酚反应的影响

1.4.3 苯酚浓度对酚反应的影响

按1.3 的方法浸泡稻谷，苯酚水溶液浓度分别为0.00（蒸馏水）、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%，浸泡 72 h，观察颜色并拍照，考查苯酚浓度对酚反应的影响。

2 结果与分析

2.1 浸泡时间对酚反应的影响

由图1 可以看出，对于籼稻而言，虽然不同稻谷的染色速度快慢不一，但随着浸泡时间的延长，被染色的稻谷颜色逐渐变深，浸泡6 h，颖尖及腹缝线处逐渐开始变褐；浸泡48 h，稻谷还没有被完全染色；浸泡72 h，稻谷已经完全变成黑褐色。因此，为确保试验结果判断的准确性，72 h 可以作为酚反应鉴别籼粳稻类型的适宜浸泡时间。由表1 可知，浸泡72 h，粳稻稻谷都没有被染色，籼稻稻谷均被染成黑褐色。实验结果与中国水稻研究所科技信息中心提供的数据相符，说明酚反应用于籼粳稻类型鉴别的正确性。

2.2 稻米形态对酚反应的影响

表2 显示，采用1.0%的苯酚溶液浸泡72 h，供试籼稻的精米都没有被染色，糙米被染成褐色，稻谷被染成黑褐色。从图2 可见，蒸馏水浸泡72 h，精米既没有发芽也没有被染色，糙米和稻谷已经发芽，但都没有被染色。1%苯酚溶液浸泡72 h，精米既没有发芽也没有被染色，糙米没有发芽但被染成褐色，稻谷没有发芽但被染成黑褐色。经苯酚处理后，糙米和稻谷都不能再发芽。

苯酚染色属于化学方法，是利用苯酚溶液的蒸汽与水稻果皮成分发生化学反应而表现特定的颜色[16]。稻谷经加工去壳得到糙米，糙米再加工去除糠层得到精米，糠层包括果皮、种皮和糊粉层[17]。精米失去了糠层，因此不会与苯酚发生显色反应。因此，用苯酚浸泡稻谷或糙米鉴别籼粳稻类型均可以得到正确的判断结果。

2.3 苯酚浓度对酚反应的影响

由表3 可知，蒸馏水浸泡，稻谷不会变色。当苯酚浓度低于0.06%时，9 种供试籼稻稻谷均没有被染色；苯酚浓度为0.06%～0.10%时，4 种供试籼稻稻谷变成浅褐色，5 种籼稻稻谷没有被染色；苯酚浓度为0.20%～1.20%时，9 种供试籼稻稻谷均被染成黑褐色。由结果可知，若苯酚浓度低于0.10%，部分籼稻稻谷不会被染色，容易导致籼粳稻类型的错误判断（如图3 的九香粘）。因此，选择浓度为0.20%及以上的苯酚水溶液浸泡稻谷就可以得到正确的染色反应结果，从而判断籼粳稻类型。

表1 稻谷苯酚染色结果与中国水稻研究所科技信息中心提供的数据的比较

图2 稻米形态对酚反应的影响

表2 稻米形态对酚反应的影响结果

3 结论与讨论

董克[15]采用浓度为1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的苯酚溶液浸泡稻谷，鉴定籼粳稻类型，结果发现浸泡24 h时染色与不染色的差异已十分明显，且不同酚浓度下谷粒染色程度差异不明显。但本试验结果表明，浸泡24 h 供试稻谷染色不明显，浸泡72 h 稻谷才被完全染色。因此，为确保试验结果判断的准确性，72 h 可以作为酚反应鉴别籼粳稻类型的适宜浸泡时间。现在公认的稻谷和糙米对酚反应的结果是一致的，本试验结果也证实了这一结论。此外，本试验还发现，苯酚浓度为0.20%～1.20%时，稻谷染色程度差异不明显，即将苯酚浓度降低到0.20%就可以对籼粳稻类型作出正确的判断，节约了苯酚试剂。

关于酚反应鉴别籼粳稻类型的适用范围，董克[15]采用酚反应研究了19 份粳稻、18 份籼稻、11 份籼粳杂交品种、21 份籼粳杂交后代的籼粳类型。得到的结论是，酚反应对粳与籼、粳与偏籼、偏粳与籼，这3 组两两类型间的鉴别非常适用，但对粳与偏粳、偏粳与偏籼、籼与偏籼，这3 组两两类型间仅采用酚反应很难加以区分。此外，籼粳杂交F1代多数为籼粳中间类型。叶昌荣等[18-19]也证实了利用酚反应难以鉴别籼粳交后代的籼粳特性。本试验的目的是详细探讨影响酚反应的有关因素，提高试验的可操作性，因此，采用常规稻作为供试材料以确保试验结果的可靠性。

表3 苯酚浓度对酚反应的影响结果

图3 苯酚浓度对酚反应的影响图片

目前，关于酚反应机理的研究，主要从化学和遗传学两个角度给予解释。张瑛[20]指出，谷壳苯酚反应的原理是单酚、双酚和多酚在酚酶作用下被苯酚氧化成黑色素，由于不同品种皮壳内酚酶的活性不同，因此反应呈现深浅不同的褐色。程新奇等[17]通过不同籼粳成分亲本及其F1谷粒的苯酚染色，证实苯酚染色反应是水稻由基因控制的品种性状，这一性状主要表现为染和不染，而染的程度与种子本身的遗传特性有关。钱前等[21]利用典型籼粳交F1代加倍所构建的DH 群体及其构建的分子连锁图谱, 对程氏6 个鉴定性状进行遗传分析和QTLs 定位，在水稻第1、4 染色体上检测到了与酚反应有关的1 个主效基因（qPH-4a） 和 2 个 QTLs（qPH-1 和qPH-4b），探讨了籼粳稻分类的分子基础。目前，尽管酚反应鉴别籼粳稻类型具有一定的局限性，但由于其不需要特殊仪器，且操作简便、快捷，因此在实际生产中仍具有实用价值。