乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA方法的建立

潘孝成，芮聪杰，2，沈学怀，赵瑞宏，尹 磊，戴 银，胡晓苗，侯宏艳，周学利，张丹俊

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031；2.伊宁市动物卫生监督所，新疆 伊宁 835000）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以水样腹泻、脱水、呕吐为主要特征的急性、高度接触性肠道传染病，各个品种和各个年龄阶段的猪均易感，尤其对刚出生至10日龄以内的哺乳仔猪影响最为严重，表现为高病死率，病死率可高达100%[1-3]。初生仔猪免疫系统不完善，通过母源抗体获得被动免疫是预防仔猪PED的重要方法[4]。PEDV主要侵害被感染仔猪的小肠上皮细胞，肠道黏膜免疫在抗病毒感染中发挥着重要的作用，IgA抗体的水平与机体抵抗PEDV感染的能力正相关[5-9]。因此建立检测母猪乳汁中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法，开展母猪PEDV免疫水平和效果的有效评估，对PED的防控具有重要的临床实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年1—5月在安徽省农业科学院畜牧兽医研究所/安徽省畜禽疫病研究中心进行。

1.2 主要材料

PEDV-SD株，安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室分离保存；Vero细胞、PEDV N蛋白重组质粒（pET-28B-N）及PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性乳汁样品和PEDV阴性乳汁样品由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室制备保存；BL21（DE3）感受态细胞购自上海生工生物工程有限公司；四甲基联苯胺（TMB）购于索莱宝生物科技有限公司；山羊抗猪IgA-HRP购于Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；Tween-20购于德国Bio froxx公司；牛血清白蛋白（BSA）购于美国Sigma公司；96孔ELISA包被板购于Corning公司。

1.3 PEDV全病毒纯化抗原的制备

将PEDV-SD毒株接种于生长状态良好、处于对数生长期的Vero单层细胞，当细胞病变达到80%时收获病毒，反复冻融3次后，收集320 mL病毒液，加入32 mL的Triton X-100，室温振荡10 min，6 000 r/min 4℃高速离心20 min，收集上清液，于超速冷冻离心机45 000 r/min 4℃超速离心120 min，弃去上清液，沉淀用适量0.01 mol/L，pH为7.4的PBS充分溶解，即得猪流行性腹泻病毒纯化抗原，测定抗原浓度后分装，-80℃冷冻保存。

1.4 PEDV重组N蛋白的制备和鉴定

将pET-28B-N重组质粒转入BL21（DE3），接于含有卡那霉素的LB液体培养基中，250 r/min，37℃振荡培养，当培养至OD600nm值达到0.4～0.6时，加入0.5 mmol/L的IPTG在15℃条件下诱导表达24 h，收集菌液，超声波裂解，10 000 g离心2 min，收集上清液过镍柱进行纯化表达的重组N蛋白，并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。收集纯化蛋白，-80℃保存备用。

1.5 间接ELISA方法的建立及优化

采用方阵滴定法，确定间接ELISA的PEDV N蛋白及纯化全病毒两种抗原的最佳包被浓度（0.5～8 μg/mL），包被液[0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），0.05 mol/L 的碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6）]，抗原包被条件（37℃孵育2 h后4℃16 h、4℃ 16 h、37 ℃孵育 2 h），封闭液的选择[1%BSA、5%BSA、5%脱脂奶粉（SMP）]，待检乳汁样品的稀释浓度（1∶10～1∶270），待检乳汁样品的反应时间（15～90 min），山羊抗猪 IgA-HRP 稀释浓度（1∶5 000～1∶100 000），山羊抗猪IgA-HRP作用时间（15～90 min），TMB显色时间（5～20 min）。

1.6 临界值的确定

按以PEDV N蛋白及纯化全病毒两种抗原为包被抗原建立的两种IgA抗体间接ELISA检测方法操作，对36份PEDV IgA抗体阴性乳汁样品进行检测，每份样品做两个重复孔，计算出所检测阴性样品OD450nm值的平均值（X）和标准方差（SD）。样品OD450nm值≥X+3×SD为阳性；样品OD450nm值≤X+2×SD为阴性；介于两者之间为可疑。

1.7 敏感性试验

将PEDV抗体为阳性的乳汁样品倍比稀释，按已建立的两种IgA抗体间接ELISA检测方法操作测OD450nm，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性，确定两种方法的最低检测稀释度。

1.8 特异性试验

按已建立的两种IgA抗体间接ELISA检测方法操作，对本实验室制备的TGEV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV阳性乳汁样品进行检测，设立PEDV阳性和阴性乳汁对照，测OD450nm，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性，评估两种方法的特异性。

1.9 重复性试验

选取4份阳性乳汁样品及1份阴性乳汁样品，每份样品做4个重复，按已建立的两种IgA抗体间接ELISA检测方法操作，使用同批次PEDV N蛋白和浓缩纯化的全病毒抗原，包被同一批次的酶标板，进行批内重复试验，另外包被不同3批次的酶标板，进行批间重复试验。

1.10 临床样品的检测

按已建立的两种IgA抗体间接ELISA检测方法操作，对采集自河南、江苏、安徽地区的6家开展PEDV免疫的种猪场（免疫次数为2次或3次）的共计198份母猪初乳样品进行检测，测OD450nm，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性。

2 结果

2.1 表达蛋白的分析和纯化

重组质粒转入BL21（DE3），诱导表达后，菌液经超声波裂解，离心后，收集上清液，过亲和层析柱纯化获取重组N蛋白，SDS-PAGE分析显示（图1A），上清液、沉淀和纯化后的产物均出现一条分子量约为58 KDa的条带，与预期大小一致，目的蛋白以可溶性表达为主。利用PEDV阳性血清进行Westernblot检测（图1B），在目的位置出现明显的特异性条带。

2.2 间接ELISA方法的建立及反应条件确定

经测定纯化后的PEDV全病毒和重组N蛋白浓度分别为3.95 mg/mL和1.23 mg/mL，以它们为包被抗原，分别建立检测PEDV IgA抗体的间接ELISA检测方法。通过方阵滴定法，确定了最佳反应条件（表1）。

表1 间接ELISA检测方法反应条件优化结果

2.3 阴阳性临界值的确定

用本试验建立的两种间接ELISA方法分别检测36份阴性乳汁样品，结果显示，以PEDV全病毒作为包被抗原，样品OD450nm≥0.431时，判定为阳性；OD450nm≤0.367时，判定为阴性；介于二者之间为可疑。以重组N蛋白为包被抗原，样品OD450nm≥0.446时，判定为阳性；OD450nm≤0.381时，判定为阴性；介于二者之间为可疑。

2.4 特异性试验

用本试验建立的两种间接ELISA方法在相同的反应条件下，分别对TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性样品进行检测，并设置PEDV阴阳性乳汁样品作为对照，结果显示（表2），除阳性乳汁样品外，其余样品结果均为阴性，表明本试验所建立的两种间接ELISA方法均具有较好的特异性。

表2 间接ELISA特异性检测结果

2.5 敏感性试验

对本试验建立的两种间接ELISA方法进行敏感性检测，结果显示（图2），以PEDV全病毒作为包被抗原，当阳性乳汁样品稀释到1∶960时，仍可检测为阳性（OD450nm=0.699）；以PEDV重组N蛋白为包被抗原，当阳性乳汁样品稀释到1∶320时，仍可检测为阳性（OD450nm=0.485）。说明建立的两种间接ELISA方法均具有良好的敏感性。

2.6 重复性试验

从表3的检测结果可以看出，两种间接ELISA方法的批内变异系数和批间变异系数均在3.39%～8.87%之间，变异系数均小于10%，表明本试验建立的两种间接ELISA方法均具有良好的可重复性。

表3 间接ELISA重复性试验（n=5）

2.7 临床样品的检测

用本试验建立的两种间接ELISA方法，分别检测198份来自6家种猪场的乳汁样品，结果显示，以PEDV全病毒作为包被抗原，检测样本的阳性率为92.93%（184/198）；以重组N蛋白为包被抗原，检测样本的阳性率为90.40%（179/198）。两种方法的检测符合率为97.48%。

3 讨论

本试验以纯化的PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原，分别建立了检测母猪乳汁中IgA抗体的间接ELISA方法，其阳性样品检测的最低稀释度分别是1∶960和1∶320，批内和批间变异系数均小于 10%（3.39%～8.87%），与 TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性样品无交叉反应，两种方法对临床样品的检测符合率为97.48%。说明本试验建立的两种检测PEDV IgA抗体的间接ELISA方法均具有良好的敏感性、重复性和特异性，能够用于检测和评估母猪乳汁中PEDV感染和免疫产生的IgA抗体水平，可为PEDV的感染和免疫效果的评价提供有效的检测方法。

猪流行性腹泻虽有多家商品化疫苗上市应用，但疫苗免疫对猪流行性腹泻的控制成效并不显著，免疫猪场的发病哺乳仔猪仍呈现高发病率和高病死率，猪流行性腹泻目前在我国呈常态化，仍是严重危害养猪生产的重要疫病之一[10]。这种免疫效果不显著的原因究竟是免疫程序不合理，还是疫苗毒株问题，有待进一步分析确定。PEDV主要侵害哺乳仔猪，并造成其大量死亡，特别10日龄内仔猪，而断奶猪和成年猪，虽然也可感染发病，但大多可康复[1-2]。大量研究表明，哺乳仔猪主要通过母猪初乳中IgA抗体而获得PED的被动免疫保护，因此母源抗体中IgA抗体水平高低对保护初生仔猪抗PEDV感染极为关键[11-12]。因此，本试验建立的乳汁中IgA抗体检测间接ELISA方法，可用于评估PEDV疫苗免疫效果和水平以及免疫程序的合理性，将有助于更好开展PED的防控。