串联质谱法检测尿皮质醇和唾液皮质醇在库欣综合征诊断中的研究进展

杜琴 赵蓓蓓 高玉婷 李冰玲 蔡国杰 蔡珂 李延兵 廖志红

1中山大学附属第一医院内分泌科，广州 510000; 2广州金域医学检验中心有限公司 510000

临床上将仅有实验室检查异常而无典型的高皮质醇临床表现(如皮肤紫纹、满月脸、水牛背、向心性肥胖等)的类型称为亚临床库欣综合征(CS)，主要是指在肾上腺意外瘤中发现的高分泌功能性意外瘤，因为症状很轻微或不典型，在临床上往往会被忽视，或混淆为代谢综合征，随着疾病进展，部分患者可发展为比较典型的临床CS[1]。亚临床CS患者具有与CS患者类似的不良临床结局，长期轻度的皮质醇分泌异常，增加了心血管疾病、糖尿病、血脂代谢异常等其他疾病的发病率和死亡率，早筛查、早诊断、早治疗很有意义[2]。而各种治疗方案均有风险，CS在诊断不明确时，不建议进行降低皮质醇水平的治疗[3]。

2018年Ben-Shlomo和Cooper[4]报道了来源于垂体的静默型促肾上腺皮质激素腺瘤，这类患者也因无典型的CS临床表现或生化检测结果，而被认为是无功能垂体腺瘤，静默型促肾上腺皮质激素腺瘤可能会转化为库欣病垂体腺瘤、甚至静默型促肾上腺皮质激素垂体癌。研究者认为，静默型促肾上腺皮质激素腺瘤的诊断也有可能是由于在疾病早期没有CS的典型表现，或由于CS的诊断切点/诊断标准问题等原因，在早期时被认为是静默型、非库欣病。

在正常人群/无功能性肾上腺意外瘤患者、亚临床CS患者和CS患者中，皮质醇水平呈“连续谱”，即从正常分泌到轻度高分泌再到过多分泌，三者之间的界限不明确，存在很大部分重叠[5]。临床迫切需求敏感性和特异性都很高的区分患者和非患者的皮质醇水平的检测方法——液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。

1 测定24 h尿游离皮质醇(24 h UFC)和午夜唾液皮质醇(MSC)的临床意义

24 h UFC反映24 h内皮质醇的整体分泌水平，与血清皮质醇相比，24 h UFC不受昼夜节律或血清皮质醇结合蛋白的影响[6]。正常情况下，肾脏过滤并部分重新吸收未结合的皮质醇，只有很小一部分(约1%～2%)以游离皮质醇的方式排出尿液；与尿皮质醇代谢产物不同，24 h UFC不受肝脏代谢变化的影响，更能反映内源性皮质醇浓度[7]。除严重肾功能损害患者外，24 h UFC与平均血清游离皮质醇水平相关性良好，被广泛用作CS筛查试验[7]。

唾液皮质醇测定的也是游离皮质醇，血游离皮质醇通过扩散进入唾液，与唾液流速无关，与血皮质醇相比，唾液皮质醇能快速、可靠地反映血浆皮质醇浓度的变化[7]，且不受皮质醇结合蛋白的影响，对于筛查正在使用雌激素治疗或者怀孕的、体内皮质醇结合蛋白升高的女性患者非常有价值。MSC反映皮质醇的昼夜节律，近年来在CS的筛查中备受青睐，虽然部分指南未提及或推荐唾液皮质醇作为亚临床CS的一线筛查试验，但MSC作为一种简便易行、效益高的检测方法，在肾上腺皮质轴功能异常评估及CS诊断中有重要地位[8-11]。MSC很敏感，如果CS的任何症状和体征出现或复发，无论症状是否轻微，MSC的测量将很快确认复发。Carrasco等[12]研究表明，MSC是一种非常可靠的术后监测患者皮质醇的方法。

2 皮质醇的检测方法

测定皮质醇的方法有免疫分析法和色谱分析法。其中免疫分析法主要为荧光法、竞争性蛋白结合分析法、放射免疫分析法(RIA)、ELISA和化学发光免疫法(CLIA)，色谱分析法主要为气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和LC-MS/MS[6-7,13]。表1汇总了免疫法、串联质谱法和GC-MS测定UFC和唾液皮质醇的差异，串联质谱法检测尿液和唾液皮质醇具有较明显的优势，详细阐述如下。

表1 免疫法与色谱/质谱法测定尿液/唾液皮质醇的区别

注：RIA：放射免疫分析法；CLIA：化学发光免疫法；GC-MS：气相色谱-质谱法

2.1 UFC的检测方法 免疫法可自动化操作，检测快速、成本低，过去的20多年里，免疫法一直是临床实际应用中测定UFC的主流方法。但它存在诸多缺点：如检测范围较窄，低浓度的灵敏性欠佳；特异性差，容易受可的松、其他内源性类固醇代谢物和外源性合成糖皮质激素(如强的松)的干扰，引起不同程度的交叉反应[14]。有研究报道显示，采用免疫法测定UFC，其中不到1%～2%是真正的游离皮质醇，其他皮质醇前体和代谢产物(如11-脱氧皮质酮、脱氧皮质醇、四氢可的松、四氢皮质醇、可的松、11-去氧可的松)占了大部分“检测皮质醇”的量，故存在检测结果偏高的情况[6,14-15]。色谱法检测尿24 h UFC的特异性较免疫法高，但需要较长的单样本分析时间来保障足够的分离度和方法特异性，因此检测通量较低，早期仅被用于免疫分析前的净化步骤，用于提高免疫法的特异性。通过将色谱法与质谱联用检测UFC，可以大大缩短分析时间、提高检测通量。近年来，GC-MS与LC-MS/MS由于其高灵敏性和高特异性，被认为是检测24 h UFC的“金标准”[7, 14, 16]。其中，LC-MS/MS在高特异性和高灵敏性的基础上，具有分析时间短、自动化程度高、检测通量高等优势，已日趋成为临床实验室UFC检测的首选。但选用LC-MS/MS方法时，需注意由于尿液或尿液提取物中大量的盐类物质和类固醇代谢物的存在，对24 h UFC的检测造成离子抑制等干扰[7]。

当患者在使用11β羟化酶抑制剂药物(如美替拉酮、LCI699)治疗CS时，由于皮质醇前体物质增多，为保证检测皮质醇的测试不与11-脱氧皮质醇发生交叉反应，只能用质谱法来评估这些药物的疗效。

2.2 唾液游离皮质醇的检测方法 临床对唾液皮质醇的测定兴趣始于20世纪60年代，但由于皮质醇在唾液中的浓度极低，不足血清皮质醇浓度的十分之一，因此对分析方法的灵敏性提出了很高的挑战。1978年，唾液皮质醇首次被RIA测定，但因唾液中较高浓度的可的松造成的严重交叉干扰反应，以及MSC的极低浓度造成的灵敏性的挑战，限制了免疫法测定唾液皮质醇的发展[7]。2003年首次有报道采用LC-MS/MS测定唾液皮质醇，该方法分析时间短，避免了在免疫法中常见的可的松等内源性化合物和强的松龙等外源性药物的干扰问题，且具有更好的灵敏性和特异性[7]。与灵敏性0.4～5.8 nmol/L的免疫法相比，LC-MS/MS的定量下限可达0.07～0.11 nmol/L[6]。随着LC-MS/MS检测唾液皮质醇的发展，LC/MS-MS将成为衡量唾液皮质醇的金标准[17]。虽然，与常规手工或自动免疫分析法相比，可以提高CS筛查的敏感性和特异性的研究尚未被完全证实[17]，但LC/MS-MS在评估唾液样本的潜在污染或局部外用合成类固醇激素造成的干扰方面非常有用。如免疫法检测MSC的测定值大于参考值上限的20倍，但患者临床症状却很轻，怀疑是泼尼松龙等合成类固醇或局部使用外用氢化可的松等外源性干扰，引起的交叉反应所致测定值偏高，此时采用LC-MS/MS同时测定唾液游离皮质醇和可的松浓度可区别干扰来源[17]。

3 24 h UFC和唾液皮质醇的参考范围

由于皮质醇的检测方法多样，且没有实现标准化和一致化，因此不同实验室之间检测结果的一致性较差，基于不同检测方法的参考区间也存在较大的差异。有指南推荐各实验室需建立基于对应检验方法的参考区间。目前关于LC-MS/MS检测24 h UFC和MSC的中国人群的参考范围，文献鲜有报道，本文汇总了几家采用LC-MS/MS检测24 h UFC和MSC的实验室所使用的参考范围，详见表2和表3。

表2 LC-MS/MS检测24 h UFC的参考范围(1 μg=2.76 nmol)

注：LC-MC/MS：液相色谱-串联质谱法；24 h UFC：24 h尿游离皮质醇

由于不同实验室的年龄划分不一致，唾液皮质醇采集的时间点不一致，不同实验室方法学也有差异，故在不同实验室间的质谱法尿/唾液皮质醇参考范围存在差异。研究表明，在健康志愿者和肥胖者之间，MSC的浓度存在很大重叠，健康志愿者唾液皮质醇的范围为0.1～16 nmol/L，肥胖者唾液皮质醇的范围为0.11～17.7 nmol/L[18]。

4 24 h UFC和MSC诊断CS的切点值

指南推荐，以24 h UFC高于正常参考值上限作为CS的初筛标准，结合进一步的检查等确诊CS[19]。由于在正常人群/无功能性肾上腺意外瘤患者、亚临床CS患者和CS患者以及肥胖人群中，皮质醇水平存在很大部分重叠，一些研究探讨了使用24 h UFC和(或)MSC来诊断CS的切点，本文回顾了2014—2018年用免疫法和串联质谱法测定24 h UFC和MSC诊断CS切点值的相关文献，归纳如表4。

表4中各项研究选取的CS研究组和对照组的研究对象不同，采用的24 h UFC和MSC检测方法不同，所得的诊断CS的切点值不同，一般认为LC-MS/MS检测24 h UFC诊断CS的切点为170 nmol/24 h[15, 24, 29]，敏感性达97%～100%，特异性达91%～99%，这也与2017年新英格兰杂志发表的综述提到的诊断CS的24 h UFC切点60～62 μg/24 h(166～170 nmol/24 h)相一致[33]。但该切点可能造成一些亚临床、轻微患者的漏诊。对于妊娠中晚期患者，24 h UFC高于正常上限3倍即可提示CS[19, 34]。表4中还看到，免疫学方法的检测24 h UFC切点值明显高于LC-MS/MS和GC-MS，这与免疫学方法检测结果高于质谱法的情况相吻合。其中Aranda等[16]研究结果，相较于LC-MS/MS检测结果的敏感性和特异性均较低，这可能与方法本身的不同或研究的入组人群差异有关，因为Aranda等入组的33例CS患者的UFC均不低于276 nmol/24 h，故可能出现了GC-MS检测尿皮质醇258 nmol/24 h的切点值明显高于其他LC-MS/MS研究的切点值[15,24,29,31-32]。24 h UFC在区分CS和肥胖等皮质醇分泌过多的患者时，需要较低的诊断切点值，但特异性不够好。MSC诊断CS仍无较一致的切点值。免疫法检测MSC诊断CS的切点值为2.76～16 nmol/L，LC-MS/MS检测MSC的切点值在1.93～14.5 nmol/L，也与不同的研究、入组对象标准不同有关。

5 总结与展望

本文仅讨论唾液皮质醇或尿皮质醇在诊断CS中的问题，没有涉及抑制试验或兴奋试验。这两个指标在每天的正常变异度比较大，需要多次测定，在皮质醇的检测方法未达到标化、一致化之前，建议临床选择方法时要了解方法的全面信息，并采用固定的实验室方法。不典型到典型CS的不同阶段中，血/尿/唾液皮质醇水平是呈正常分泌到轻度高分泌再到过多分泌的“连续谱”，界限有一定的重叠。临床上，伴有非创伤性皮肤瘀斑、皮肤薄、与年龄不相称的骨量低等代谢综合征患者，要注意对CS的筛查，对可疑亚临床CS患者要长期随访、通过对干预治疗的反应等来进一步明确临床判断。针对皮质醇的检测，质谱法检测24 h UFC和MSC较其他方法有较明显的优势，对于LC-MS/MS检测24 h UFC诊断CS的切点值多为170 nmol/24 h，但该切点值针对一些亚临床、轻微患者的敏感性不足，可能存在漏诊。MSC方面，尚无较一致的诊断CS切点值。目前临床上可能需要同时采用质谱法和免疫法检测24 h UFC，但随着MSC检测的普及，同时检测MSC和24 h UFC也是提高CS诊断的敏感性和特异性的有益方法。一些代谢综合征患者在长期的疾病发展演变过程中是否会发展为CS，以及非典型、轻微、亚临床CS情况下，不同干预对于长期预后的影响等问题仍然需要进行大规模的前瞻性研究；不仅是质谱法测定皮质醇，未来用质谱法检测皮质醇及其代谢产物或糖皮质激素代谢组学的分析，也将为这些研究提供更好的支持。

表3 LC-MS/MS检测唾液皮质醇的参考范围(1 μg/dl=27.6 nmol/L)

注：a与Mayo Medical Laboratories参考范围相同；LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱法

表4 24 h UFC和MSC在诊断CS的切点值文献汇总

注：CLIA:化学发光免疫法；ECLIA:电化学发光免疫法；RIA:放射免疫分析法；ELISA:酶联免疫吸附法；GC-MS:气相色谱质谱法；LC-MS/MS:液相色谱-串联质谱法；CS:库欣综合征；NOCS:非库欣综合征；SCS:亚临床库欣综合征；NFA:肾上腺无功能腺瘤；HV：健康志愿者；OS:肥胖/超重;CDIR:达到缓解的库欣病；NM:未提及；CD=CS