羟苯磺酸钙对动脉粥样硬化斑块形成的影响及其机制

王莹，李彩，朱峰，金笑平

（台州医院神经内科，浙江台州317000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是多数心脑血管疾病的共同病理基础，主要表现为动脉壁内大量脂质和纤维组织蓄积并伴有局部炎性反应，严重威胁患者的心身健康[1]。AS早期即表现为内皮功能障碍，调节内皮功能可有效防治AS导致的心脑血管疾病。羟苯磺酸钙作为一种血管保护剂，可以改善局部血液循环，已广泛应用于治疗糖尿病相关并发症和肾功能不全相关疾病，而其对AS斑块形成影响的研究较少[2]。本研究旨在以液氮冻伤术建立兔AS斑块模型，并给予羟苯磺酸钙干预，以探讨羟苯磺酸钙对AS斑块形成的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级健康雄性新西兰兔24只，兔龄为3～4个月，体质量1.9～2.2kg，购自温州医科大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK（浙）2015-0001]。羟苯磺酸钙由西安利君制药有限责任公司生产，批号0706057。内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（nitricox-ide，NO）和血管内皮生长因子（vascularendothe-lialgrowthfactor，VEGF）ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所，基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1）及SP超敏试剂盒购自上海天呈科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兔AS斑块模型的建立：所有动物适应性喂养3d，以液氮冻伤术建立AS斑块模型，模型的制作参照FANG等[3]的方法，即以3%戊巴比妥钠（30mg/kg）进行全身麻醉，分离右颈总动脉，血管两端以动脉夹阻断血流，以0.9%氯化钠溶液冲洗后抽空血管腔，再以1mL注射器抽取液氮，快速注入血管腔，反复3次以造成血管内皮损伤。放开动脉夹恢复血流，缝合肌肉组织及皮肤，常规使用抗生素预防感染。实验程序遵循动物保护和应用条例。

1.2.2 分组与处理：造模后将兔随机分为治疗组和模型组，每组各12只。治疗组于造模当天开始给予羟苯磺酸钙（0.15mg/g/d）+高脂饲料（含1%胆固醇、3%大油、15%蛋黄和81%普通饲料）喂养，模型组仅给予高脂饲料喂养，连续8周。

1.3 检测指标

1.3.1 组织病理学检查：8周后处死兔，取出右颈总动脉2～3cm，一部分以4%多聚甲醛固定24h，常规脱水，石蜡包埋，制备4μm厚连续石蜡切片，作HE染色和弹力纤维染色，光镜观察AS斑块病理形态；另一部分以3%戊二醛溶液固定，超薄组织切片，醋酸铀及枸橼酸铅双染色，JEM-1230透射电镜观察AS斑块病理形态。

1.3.2 免疫组织化学染色：取上述右颈总动脉石蜡切片，采用SP法测定斑块中MMP-9和PAI-1蛋白表达，DAB显色，棕黄色颗粒状产物为阳性标记。具体步骤参照试剂盒说明书进行。采用LeicaQWINV3图像分析系统对免疫组织化学结果进行分析，每张玻片标本均随机选取8个视野，以平均灰度值表示检测的右颈总动脉各层染色阳性面积。

1.3.3 ELISA检测：治疗前及治疗8周后分别抽取各组兔耳缘静脉血2mL，离心分离血清，ELISA法检测血清ET-1、NO及VEGF含量。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理。计量资料以表示，组间比较采用两样本t 检验，组内比较采用配对t 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理形态学检测结果

2.1.1 HE染色：治疗组右颈总动脉可见内膜、中膜增厚，平滑肌增殖并向内膜迁移，血管腔内可见一层不规则的较薄斑块，内含泡沫细胞和炎性细胞（见图1A）。模型组右颈总动脉内膜、中膜增厚明显，血管腔内可见半球形脂质斑块显著隆起，斑块表面有纤维组织覆盖，形成典型的“纤维帽”，内含大量泡沫细胞及炎性细胞浸润（见图1B）。

图1 治疗8周后兔右颈总动脉斑块形成情况（HE染色，×200）

2.1.2 弹力纤维染色：治疗组右颈总动脉弹力纤维和胶原纤维形态不规则，排列稍紊乱，胶原纤维增多，蓝黑色的内弹力板以内可见较薄脂质斑块（见图2A）。模型组右颈总动脉弹力纤维和胶原纤维排列紊乱，蓝黑色的内弹力板以内有断裂现象，可见突向血管腔的较大脂质斑块（见图2B）。

2.1.3 透射电镜：治疗组右颈总动脉中层平滑肌细胞梭形，排列稍紊乱，间质增宽，结缔组织增生，胞质内见微丝及密体密斑，内膜及中膜可见少量脂滴（见图3A）。模型组右颈总动脉内膜呈斑块状增生，细胞结构不清，内弹力膜增厚变性，中层平滑肌细胞排列紊乱，间质增宽，中膜结缔组织增生，内膜及中膜可见大量脂滴，高度空泡变性（见图3B）。

图2 治疗8周后兔右颈总动脉内膜病变情况（弹力纤维染色，×200）

图3 治疗8周后兔右颈总动脉斑块处透射电镜表现

2.2 免疫组织化学检测结果 8周后，抗MMP-9、PAI-1染色发现，MMP-9、PAI-1阳性染色为棕褐色，治疗组可见右颈动脉斑块处MMP-9、PAI-1呈散在弱阳性表达，而其在模型组则表达明显增高，呈强阳性表达。治疗组MMP-9、PAI-1在上述部位的表达量较模型组明显减少（P均＜0．05）。见图4-5和表1。

图4 治疗8周后兔右颈总动脉斑块处MMP-9表达情况（DAB染色，×200）

图5 治疗8周后兔右颈总动脉斑块处PAI-1表达情况（DAB染色，×200）

表1 2组兔右颈总动脉MMP-9和PAI-1免疫组织化学灰度值比较（每组n=12

表1 2组兔右颈总动脉MMP-9和PAI-1免疫组织化学灰度值比较（每组n=12

与模型组比：aP ＜0.05

组别 MMP-9 PAI-1模型组 136.97±7.81 145.02±10.26治疗组 118.08±14.36a 126.15±8.65a

2.3 ELISA检测结果 治疗前两组血清ET-1、NO及VEGF表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗8周后，2组ET-1水平均显著降低，NO、VEGF水平均显著升高，且治疗组血清ET-1水平低于模型组，NO、VEGF水平高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 2组血清ET-1、NO及VEGF水平比较（每组n=12

表2 2组血清ET-1、NO及VEGF水平比较（每组n=12

与组内治疗前比：aP ＜0.05；与模型组治疗后比：bP ＜0.05

组别 ET-1（ng/L） NO（μmol/L） VEGF（pg/mL）治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组 103.32±15.45 90.81±12.10a 21.23±5.54 26.26±4.35a 22.12±3.90 27.21±4.92治疗组 101.95±16.07 76.32±10.01ab 20.95±3.72 31.47±4.09ab 21.83±3.72 32.58±5.46ab

3 讨论

目前，有关AS斑块形成机制的学说主要有：内皮损伤学说、脂质浸润学说、慢性炎症学说、平滑肌细胞增生学说、血栓源学说等[4-5]，其中血管内皮损伤和脂质浸润被认为是导致AS的始动因素[6]。

AS疾病普遍存在内皮功能障碍[7]。研究表明，内皮细胞可通过释放血管活性物质如NO和ET-1等调控血管内皮细胞的功能[8]。NO是由NO合酶催化左旋精氨酸氧化生成，它不仅参与介导血管舒张，使平滑肌松弛，对血管有一定的保护作用，还能阻止血小板的聚集和黏附，具有显著的抗血栓形成作用。ET-1则正好相反，可以引起血管收缩，激活巨噬细胞，引起血小板聚集，损害血管内皮，促进平滑肌细胞增殖和迁移，促使AS的形成[9]。病理状态下，血管内皮功能出现紊乱，NO降低，并促进ET-1分泌，造成血管痉挛，诱导AS形成[10]。我们可以通过调节NO和ET平衡，维持血管内皮功能正常及结构完整，从起始环节干预AS斑块形成[11]。此外，VEGF可通过促进NO合成酶的生成，进而促进NO的生成，与NO共同作用发挥舒张血管的作用，促进新生血管的稳定和成熟，避免血栓形成，减轻AS发病程度[12]。由于VEGF在正常血管中基本无表达，而在AS斑块中表达显著增加，它能特异性地促进血管内皮修复与新生血管形成，促进AS斑块的形成，所以，VEGF在加速AS斑块形成过程中也具有重要作用。

目前研究认为，AS的发展过程与细胞外基质的降解、平滑肌细胞迁移和基质再生等密切相关[13]。MMP-9作为基质金属蛋白酶类中相对分子质量最大的酶，是降解IV、V型胶原最主要成员之一。胶原纤维的降解降低了内皮细胞基底膜的完整性，促使中膜平滑肌细胞向内膜迁移，在AS病变及斑块的破裂中发挥最关键性的作用[14]。PAI-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在正常血管内皮细胞中合成。PAI-1可能通过影响血管内皮再生、平滑肌细胞迁移、动脉附壁血栓形成等环节参与AS的形成。当血管内皮细胞损伤时，血浆PAI-1等纤溶因子水平异常，启动和加速AS的发生发展[15]。

羟苯磺酸钙作为血管保护剂，已广泛应用于糖尿病肾病、慢性静脉功能不全、冠心病等的治疗[16-17]。研究证实[18]，羟苯磺酸钙能通过减少内皮细胞中山梨醇的形成，减轻血管内皮的损伤，抑制血管活性物质及血小板的活化和聚集，降低毛细血管的通透性和脆性，从而对血管发挥一定的保护作用。

在本研究中，我们通过液氮冻伤术结合高脂饮食建立兔AS斑块模型，再以羟苯磺酸钙干预模型兔，结果表明，羟苯磺酸钙不仅能降低血循环中ET-1含量，升高NO、VEGF水平，还能减少血管壁局部组织中PAI-1和MMP-9蛋白的表达，说明羟苯磺酸钙可能从保护血管内皮、延缓动脉硬化及稳定粥样斑块等方面保护大血管。因此，羟苯磺酸钙能明显改善AS斑块形成的可能机制是减轻内皮细胞损伤，增加血管内皮细胞的密度，减少微血栓形成，进而阻止AS斑块的发生发展。