宫颈癌细胞培养上清液诱导THP-1巨噬细胞M2表型

窦晓青，温明晓，朱迎萍，张淑珍，徐献丽，许江燕

（浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州310000，1.妇产科；2.检验科）

宫颈癌是发展中国家女性癌症第三大死亡原因[1]。虽然治疗宫颈癌的手术、肿瘤免疫治疗等多种方法已取得初步成果，但仍有部分患者存在复发风险，这与癌组织局部的肿瘤微环境密切相关。在宫颈癌的肿瘤微环境中，巨噬细胞占所有细胞比例高达30%～50%，预示其对于肿瘤发生发展的关键作用[2]。根据巨噬细胞表型可将其分为M1及M2型，其中M1型巨噬细胞发挥杀伤细胞内病原体、破坏肿瘤、促进Th1免疫反应的作用；而M2型巨噬细胞可通过表达血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、程序性死亡配体1等促进肿瘤的发生发展，与癌症不良预后密切相关[3-4]。研究发现，宫颈癌组织中浸润的巨噬细胞以M2型为主，且宫颈癌可通过分泌IL-4、IL-10来促进巨噬细胞向M2极化[3]，但这些细胞因子是否在诱导或维持M2巨噬细胞表型中发挥重要作用尚未明确。为此，本研究探讨宫颈癌细胞系（HeLa）培养上清液是否可诱导并维持THP-1巨噬细胞M2表型，以明确HeLa细胞培养上清液对THP-1巨噬细胞分化的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 流式抗体CD206-FITC、CD163-FITC、HLA-DR-APC、STAT1-PE、pSTAT1-PE、STAT6-PE和pSTAT6-PE购自美国BioLegend公司；IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 细胞因子检测试剂盒购于深圳达科为公司；HumanGrowthFactorPanelMulti-analyteFlowAssay试剂盒购自美国BioLegend公司；硝酸全氮/亚硝酸盐比色法试剂盒购自美国R&D公司。抗pSTAT6抗体购于美国BioLegend公司。

1.2 方法

1.2.1 HeLa细胞培养上清液收集及细胞因子检测：将HeLa细胞系以1×105个/孔接种于6孔板中，培养体系为DMEM的完全培养基（含10%的FBS，1%的双抗）。细胞培养至第3天时，收集细胞并离心收集上清液，分装后冻存于-80℃冰箱。使用深圳达科为公司的细胞因子检测试剂盒和美国BioLegend公司的HumanGrowthFactorPanelMulti-analyteFlowAssay试剂盒测定细胞因子和生长因子，操作按说明书进行。

1.2.2 实验分组及处理：实验分组：空白对照组（Mθ组）、M2细胞诱导组（M2组）、HeLa细胞培养上清液处理组（Mθ+sHeLa组）。THP-1细胞系以1×106个/孔接种于12孔板中，培养体系为RPMI-1640完全培养基（含10%的FBS，1%的双抗）。待细胞培养至对数生长期，收集THP-1并用无菌PBS洗涤3遍后进行如下处理。Mθ组：不做刺激处理的基础状态；M2组：20ng/mLIL-4、20ng/mLIL-10 处理3d；Mθ+sHeLa组：加入50%HeLa细胞培养上清液处理培养3d。

1.2.3 流式细胞术检测巨噬细胞CD163、CD206和HLA-DR的表达：离心收集1.2.2中的巨噬细胞并用PBS洗涤3 次，加入Fc受体阻断剂于37℃封闭阻断人Fc受体30min；PBS洗涤3次后，加入CD163-FITC、CD206-FITC或HLA-DR-APC抗体1mL，4℃孵育30min，PBS洗涤3次后，调整终体积至300mL，流式仪上机检测。

1.2.4 HeLa细胞培养上清液处理后的巨噬细胞产生细胞因子、生长因子、TGF-β3水平检测：用HeLa细胞培养上清液处理THP-1巨噬细胞3d后，500r/min离心收集细胞上清液。使用流式细胞术检测细胞因子和血管生成素-2（angiopoietin-2，ANG-2）、肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）、VEGF。利用Bio-PlexProTMTGF-β3-Plex试剂盒分析TGF-β3的产生。细胞因子、生长因子和TGF-β3浓度以pg/mL表示，以上操作均按说明书进行。

1.2.5 去除HeLa细胞培养上清液48h后THP-1巨噬细胞产生生长因子能力变化：为评估在去除HeLa细胞上清液后，巨噬细胞分泌细胞因子及生长因子情况。先用HeLa细胞培养上清液处理THP-1巨噬细胞3d，随后用新鲜的DMEM完全培养基替换HeLa细胞上清液后继续培养48h。最后，500r/min离心收集细胞上清液并检测细胞因子、生长因子、TGF-β3的浓度。

1.2.6 JAK-STAT6信号通路影响HeLa细胞培养上清液对THP-1的分化效果：离心收集并用PBS洗涤各组处理3d后的巨噬细胞，用破膜固定液于冰上处理细胞20min，随后用BD染色缓冲液洗涤细胞3次，最后加入STAT6-PE或pSTAT6-PE抗体1μL，4℃避光孵育30min。用PBS洗涤并重悬细胞后上机检测。使用FlowJo对结果进行分析，以平均荧光强度（meanfluorescenceintensity，MFI）展示实验结果。提取THP-1细胞蛋白，采用BCA法进行定量，SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入pSTAT6 一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入相应HRP标记的二抗室温孵育2h，滴加ECL发光，显影，使用ImageJ进行灰度分析。

图1 HeLa细胞培养基中细胞因子（A）及生长因子（B）的检测

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad5软件进行数据分析。计量资料采用表示，多组比较采用单因素方差分析，采用Student’st 检验分析组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HeLa细胞分泌的细胞因子 HeLa细胞分泌的细胞因子如图1所示，HeLa分泌的代表性细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）及生长因子（ANG-2、HGF、VEGF）表达的水平。在细胞因子方面，HeLa细胞分泌IL-6较多；在生长因子方面，则以HGF、VEGF含量较多。见图1。

2.2 HeLa细胞培养上清液对巨噬细胞表面受体和转录因子表达的影响 为探讨HeLa细胞培养上清液对巨噬细胞极化的影响，用HeLa细胞培养上清液处理巨噬细胞3d后，收集细胞分析M1和M2表型表面受体的表达水平，结果见图2。与Mθ组比，M2组及Mθ+sHeLa组的M1型细胞极化相关的细胞表面标记物（HLA-DR）表达差异无统计学意义（P＞0.05），而M2型细胞极化相关的细胞表面标记物（CD163和CD206）含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 HeLa细胞培养上清液处理的THP-1巨噬细胞膜受体HLA-DR、CD163和CD206的检测

2.3 HeLa细胞培养上清液处理后的巨噬细胞产生细胞因子、生长因子水平 为探讨HeLa细胞培养上清液对巨噬细胞释放细胞因子、生长因子的影响，用HeLa细胞培养上清液处理巨噬细胞3d，流式细胞术检测胞内细胞因子，收集细胞上清液检测生长因子水平，结果见图3。与Mθ组比，M2组及Mθ+sHeLa组细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Mθ组比，M2组及Mθ+sHeLa组的HGF、ANG-2和VEGF明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Mθ组比，M2组及Mθ+sHeLa组的TGF-β3分泌增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 HeLa细胞培养上清液处理后的THP-1巨噬细胞分泌细胞因子、生长因子、TGF-β3水平的检测

2.4 去除HeLa细胞培养上清液48h后巨噬细胞细胞因子、生长因子及TGF-β3水平 与Mθ组比，去除HeLa细胞培养上清液48h的巨噬细胞（Mθ+sHeLasHeLa组）分泌IL-4、IL-6、IL-10、Ang-2、HGF、VEGF浓度增加（P＜0.05）；同时，与Mθ组比，Mθ+sHeLa-sHeLa组TGF-β3增加（P＜0.05），见图4。

图4 去除HeLa细胞培养上清液48h后THP-1巨噬细胞中细胞因子、生长因子、TGF-β3蛋白水平

2.5 JAK-STAT6信号通路参与HeLa细胞培养上清液对M2型巨噬细胞的分化 M2型巨噬细胞极化相关转录因子（STAT6、pSTAT6）表达如图5所示，与Mθ组比，Mθ+sHeLa组的巨噬细胞pSTAT6表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。HeLa细胞培养上清液可通过激活JAK-STAT6信号通路诱导巨噬细胞向M2型分化。

3 讨论

浸润肿瘤组织中的巨噬细胞通常称为肿瘤相关的巨噬细胞，其对肿瘤的发展起重要作用。巨噬细胞可在不同条件的诱导下向M1或M2极化，其中M2表型巨噬细胞参与促进Th2免疫反应，并通过表达VEGF、TGF-β、吲哚胺2，3-双加氧酶、程序性死亡配体1促进肿瘤的发生，且M2巨噬细胞的存在与不良预后有关[2]。本研究初步分析宫颈癌细胞培养上清液相关生长及细胞因子水平，并探讨其对于巨噬细胞极化的影响。

肿瘤细胞所释放的细胞产物一方面促进血管生成、新陈代谢、肿瘤相关细胞募集和肿瘤增长[5-6]；另一方面，它们也可诱导M2表型巨噬细胞，在维持免疫抑制微环境、促进血管生成和代谢方面发挥重要作用[7]。胃癌细胞通过释放的IL-4、IL-10、单核细胞集落刺激因子引起肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociatedmacrophages，TAMs）向M2表型极化[8]。本研究发现HeLa细胞培养上清液中有高浓度的IL-6、IL-4、HGF、VEGF。细胞因子IL-6、IL-4被认为参与单核细胞分化成肿瘤相关巨噬细胞样细胞的过程中，同时也是诱导M2表型巨噬细胞的重要因子[9]；VEGF和HGF一样具有较强的促血管生成作用，共同参与肿瘤的发生发展过程[10]。这表明，HeLa细胞上清液也一方面可通过释放IL-6、IL-4 等细胞因子诱导TAMs向M2表型极化，另一方面也可通过释放HGF、VEGF可通过促进血管生成、新陈代谢、肿瘤相关细胞募集和肿瘤生长。

图5 流式细胞术及Westernblot检测巨噬细胞中pSTAT6水平

在本研究中，经HeLa细胞培养上清液处理后的M2巨噬细胞标记物的CD163、CD206表达上调，说明HeLa细胞培养上清液可诱导巨噬细胞向M2细胞极化。同时，HeLa细胞培养上清液处理后的巨噬细胞可释放大量ANG-2、HGF、VEGF。ANG-2作为M2表型的巨噬细胞分泌的代表性生长因子，可发挥促进肿瘤生长作用，它与HGF、VEGF一道通过不同方式促进肿瘤细胞生长。重要的是，在去除Hela细胞培养基48h后，巨噬细胞可持续高表达IL-4、IL-6、IL-10以及ANG-2、VEGF、HGF，这预示在切除肿瘤后，受到原先肿瘤局部微环境影响的M2型巨噬细胞可继续分泌相关细胞因子及生长因子来促进肿瘤复发。既往研究显示TGF-β3 的高表达可促进肿瘤发生发展，并且M2型巨噬细胞分泌的TGF-β3也可通过自分泌的形式作用于自身，进一步促进巨噬细胞向M2极化[7]。在黑色素瘤与乳腺癌中，TGF-β3 的高表达与病情加重及不良预后有关[11]。本研究同样发现经过Hela细胞培养上清液处理后的巨噬细胞释放TGF-β3水平升高，也提示其在宫颈癌中的重要作用。

JAK/STAT信号通路与由各种细胞因子诱导的各种生物学应答有关，在非受体型JAK的作用下，转录因子STAT磷酸化并发生二聚化，磷酸化的STAT转位至核内，激活相关基因表达；转录因子STAT分为多种亚型，其中STAT6与M2相关特异性基因表达有关，研究发现IL-4等细胞因子可通过激活JAK/STAT6途径调节巨噬细胞M2的极化[12]。本研究也发现HeLa细胞培养上清液处理后的巨噬细胞中磷酸化STAT6水平增加。由于HeLa细胞培养上清液存在IL-4等多种细胞因子，因此可以推测HeLa细胞是通过释放相关细胞因子来激活JAK/STAT6途径，进而导致巨噬细胞向M2极化。

本研究也存在不足，首先本研究采用Hela细胞系，和真实肿瘤细胞存在差异；其次，HeLa细胞系及巨噬细胞可分泌诸多细胞产物，而本研究仅检测少数几种与M2巨噬细胞极化有关的细胞因子及生长因子，其余细胞产物的作用还需后续深入研究。

综上所述，HeLa细胞培养上清液可诱导巨噬细胞向M2表型的极化，参与肿瘤的生长和血管生成。