卵叶远志根茎结构特征及内含物鉴别研究

吕鼎豪，李香串，牛俊峰

(1.山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006；2.陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710119)

远志始载于《神农本草经》，为我国重要的大宗药材之一，也是国家重点保护的三级野生品种[1]。《中国药典》(2015 版)规定了远志为远志科植物远志(Polygalatenuifolia) 或卵叶远志(Polygalasibirica)的干燥根[2]，具有安神益智、祛痰、消肿等功效。远志主要分布在山西、陕西、河南等北方地区，由于细叶远志主根粗壮、分叉少、易抽芯、商品性状突出等优点，早在90年代初就已实现人工驯化，目前市场上远志主流商品为细叶远志，有关远志的报道主要集中于细叶远志的栽培管理、品质评价、化学成分和药理研究等方面[3-6]。卵叶远志由于野生资源分散，尚无规模化栽培，采样难等因素致使卵叶远志相关研究较少。通过对细叶远志和卵叶远志转录组直系同源多序列的比对，发现卵叶远志遗传变异量较小，进化起源更早，卵叶远志中很可能存在特有的药效成分和功能基因有待进一步发掘。针对远志上述存在的问题，本课题开展卵叶远志不同年限根茎解剖结构比较研究，分析卵叶远志地下部分生长发育规律及农艺性状特征，以期为卵叶远志种质鉴定、栽培育种以及资源开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年10月13日在山西清徐远志资源圃内，随机对不同种植年限(1 a、2 a、3 a)的远志植株进行采样，每份样本3次重复，每个重复均取三株材料作为一个混样，采样后去净泥土及杂质，测量其形态数据。

1.2 试验方法

1.2.1 形态解剖学方法

将远志地下部分的根茎分割后用FAA固定液固定，采用常规石蜡切片法切片，番红—固绿染色，中性树胶封片，在Olympus显微镜观察并照相。地下部分取材切割部位为远志根茎直径的最大处。

1.2.2 组织化学方法

以新鲜材料进行徒手切片，放置于载玻片上，并分别滴加5%香草醛～冰醋酸和高氯酸混合试剂、苏丹Ⅲ染液、1%碘—碘化钾试剂、间苯三酚等染液进行染色[7]，显色后在Olympus显微镜观察并照相。

1.2.3 生物量测定

用卷尺和数显游标卡尺测量远志植株长度与根茎直径，用电子天平分别对植株地上部分鲜重、地下部分鲜重、全株鲜重进行称重。

1.3 数据统计与分析

统计数据计入Microsoft Excel 2007，使用 SPSS 22.0分析软件对数据进行多重相关分析。

2结果与分析

2.1 根茎形态特征及地下芽库

卵叶远志地下部分的主根直立或斜生，根部节与节明显，节上有芽(图1，A～C)，因此属于根状茎，以下均简称根茎[8]。根茎近地侧的顶芽为有芽鳞包被着的活动芽，可向上生长形成营养枝和生殖枝，有繁殖的作用；远地侧的不定芽为休眠芽，待活动芽受损或生长受阻后开始发育。按照所形成的器官性质划分，卵叶远志根茎芽归为混合芽[9-10]。

卵叶远志根茎横切面上的维管组织排列近圆筒状，常伴有缺刻，这是茎的典型枝隙结构。缺刻处填充有大量的薄壁细胞，在纵切面中表现为排列紧密呈半圆状凸起的细胞团，即叶芽原基(图1，D～E)，这是叶芽发育的开始。随着叶芽内维管束原基不断发育，内部穿透形成层与新梢上的维管束连通，形成完整的芽体维管束系统，最终芽体发育成卵叶远志地上部分茎和叶。这充分证明了卵叶远志的主根与茎结构一致，因此卵叶远志主根应归为根茎。在卵叶远志根茎芽点横切结构中，中央处为茎的初生结构，从外到内由表皮、皮层、维管柱3部分组成(图1，F～G)。皮层细胞与维管柱之间以加厚凯氏带相分隔，维管柱中央部分为髓，导管多为环纹导管。在茎初生结构周围为雏叶，雏叶边缘板状分生组织进行垂周与平周分裂，使叶片边缘侧向扩展的同时叶面积也不断扩大。

2.2 根茎解剖结构特征

卵叶远志与细叶远志的根茎结构一致，从外到内均由周皮和次生维管组织组成(图2，A、D)。周皮外方为排列紧密的木栓层，覆角质化膜。栓内层细胞发达，细胞壁呈不均匀加厚，为主要细胞类型，约占横切面的66%。根茎中央无髓，维管束排列近圆筒状，常出现缺刻现象(图1，D；图2，A、B)。次生维管组织包括次生木质部、维管形成层及次生韧皮部。次生韧皮部位于栓内层内方，主要由7～10层圆状或近椭圆状的韧皮薄壁细胞构成(图2，E)。靠近栓内层的韧皮薄壁细胞体积较大，筛管和伴胞多已被挤毁，发育较晚靠近次生木质部的韧皮薄壁细胞体积较小，细胞壁加厚不明显。维管形成层细胞2～3层，紧密横向排列，未形成明显的环状条带。根茎中央为次生木质部(俗称木芯)，约占根茎直径的34%。次生木质部中木纤维集群分布，少见单个分散，与导管交替排列。导管口径大小不一，星散分布。与之相邻的木射线发达，多为1～2列长方形木射线薄壁细胞，体积较大，依次紧密排列呈辐射状径向外延。而在细叶远志维管组织的木质部中，双列木射线明显，数量较多，将木质部分割成芒状(图2，C)，木质部外侧边缘呈不规则齿状向外发散，为细叶远志根茎典型特征之一。

从远志根茎纵切面看，周皮中的木栓层细胞结构清晰，无细胞重叠，便于计数，且易观察维管结构、芽库结构以及木芯所占比例，因此建议有关远志根茎显结构观察中，应添加纵切结构示意图。

图1 卵叶远志根茎形态及芽库Fig. 1 Morphological characteristics of the rhizome of P. sibirica

注：A．卵叶远志植株；B～C．卵叶远志根茎，示芽库；D～E．卵叶远志根茎解剖结构，示枝隙；F～G．卵叶远志根茎芽的显微结构；Ad．活动芽；Db．休眠芽；Bg．枝隙；Bd．芽点；Lb．叶芽原基；St．茎

2.3 根茎中的“年轮”结构

在细叶远志与卵叶远志根茎结构的观察中，发现两种远志木质部中的维管均呈同心圆环的方式排列，这是植物茎中典型的年轮线结构(图2，B、C)。其中早材和晚材共同构成了一个生长层，即一个年轮[11]。经过对远志36个样本观察显示，1 a生远志有2个生长层，2 a生远志有4个生长层，三年生远志共有6个生长层，表明远志在一年中可以形成2个假年轮(见图7，A～H)，因此可通过计数远志木质部生长层数来鉴别远志药材的生长年限。

图2 卵叶远志根茎显微结构Fig. 2 The micro-morphological structure of the rhizome of P. sibirica

注：A．卵叶远志根茎横切面，示各部分比例；B．卵叶远志根茎次生木质部，示年轮结构；C．细叶远志根茎次生木质部；D．卵叶远志根茎部分横切面， 示周皮结构；E～F．卵叶远志根茎横切面，示紫红色圆状颗粒；CL．木栓层；PP．韧皮薄壁细胞；Ph．木栓形成层；Pd．栓内层；SP．次生韧皮部；SX．次生木质部；Gr．年轮；X．内含物

2.4 根茎生长节律分析

不同种植年限卵叶远志的根茎解剖结构无明显差异，但随种植年限的增加各类细胞的数量和所占的面积均明显增加。1 a生卵叶远志根茎长14.9 cm，根茎直径3.21 mm，平均根茎重1.24 g，次生木质部约占根茎直径的37%～45%，木芯比41%，根皮份额占83.3%。2 a生卵叶远志根长增长率2.08%，根茎直径4.52 mm，根直径增长率40.8%，木芯比为39%，根皮份额占84%。3 a生卵叶远志根茎长15.87 cm，年增长率4.34%，根茎直径达5.85 mm，年增长幅度29.42%，木芯比32%，根皮份额为95.4%。结果表明卵叶远志在第2和第3年生长期内，根茎形成层细胞平周分裂旺盛，垂周分裂较少，根茎加粗膨大，增产明显。

通过对卵叶远志农艺性状的对比发现，1 a、2 a、3 a生卵叶远志整株重分别为7.62 g、11.74 g、17.11 g，第二年增幅54.06%，第三年增幅45.74%。地下部分根茎重分别为1.24 g、1.59 g、2.38 g，第二年增幅28.20%，第三年增幅49.70%。结合根冠比0.2、0.16、0.2的变化规律，表明处于第二年生长期的卵叶远志所积累养分多用于地上部分的生长(详见表1，图3)。从1 a、2 a、3 a生卵叶远志的平均根茎长度14.9 cm、15.21 cm、15.89 cm分析，卵叶远志根茎的纵向发育主要在第一年完成，第二年生长期内，进行地上部分发育与根茎横向增粗；从产量上看，3a生卵叶远志比2a生卵叶远志产量提高约1.5倍，但根茎长度不增加，说明卵叶远志侧根的发育主要在第三年。

图3 卵叶远志根茎的生长节律Fig. 3 The growth rhythm in the rhizome of P. sibirica

2.5 根茎贮藏物鉴别

在番红—固绿染色实验中，1 a、2 a、3 a生卵叶远志根茎的栓内层与韧皮薄壁细胞内均广泛分布有大量的紫红色圆状颗粒。韧皮薄壁细胞中颗粒体积较大，数量少，栓内层细胞中的颗粒小而密集(图2，D、E、F)。而在3个产地27份细叶远志的根茎细胞中均未发现有紫红色圆状颗粒，因此根茎中有无紫红色圆状颗粒可作为远志鉴别依据之一。本研究采用不同组织化学定位法对圆状颗粒成分进行显色判别。

表1 远志农艺性状比较

2.5.1 三萜皂苷的组织化学定位

远志皂苷能与皂苷显色剂香草醛一冰醋酸和高氯酸混合试剂发生显色反应，呈现出淡红—紫红颜色变化。组织化学定位研究表明，在细叶远志和卵叶远志根茎中，栓内层及次生韧皮部均呈紫红色，木栓层和次生木质部显黄色(图4，A、B)。可以看出在远志的根茎中均具有远志皂苷的积累，其中细叶远志根茎显色较深，皂苷积累比卵叶远志多。经放大观察，皂苷显色剂处理下远志根茎胞内圆状颗粒未着色，因而圆状颗粒不属于皂苷类物质。

2.5.2 脂肪油的组织化学定位

油脂属于植物后含物中营养贮藏物质，脂肪油的组织化学定位常用苏丹Ⅲ染液显示桔红色进行判别。经苏丹Ⅲ染色，卵叶远志根茎细胞中无桔红色油滴，而细叶远志根茎的栓内层细胞中具有丰富的巨型桔红色油滴，其木栓层和次生木质部中未发现桔红色油滴(图4，C、D)。说明卵叶远志根茎中没有油滴存在，这与滕红梅等人的研究结果相符[14]。由于细叶远志根茎中油滴形态与紫红色圆状颗粒的体积差异显著，因而圆状颗粒不属于脂类物质。

2.5.3 糖类物质的组织化学定位

通常贮藏组织内所含的最普遍的物质是淀粉，或含有丹宁成分的薄壁细胞。在淀粉粒的显色反应中，碘—碘化钾试剂可使胞内蛋白质和淀粉同时染色，其中蛋白质呈黄色，淀粉呈蓝色[7]。组织化学定位研究表明，显色后的卵叶远志根茎细胞呈黄色，胞内无蓝黑色淀粉粒，栓内层细胞中圆球状颗粒着色较浅，略显黄色，疑为植物蛋白颗粒(图4，E)。在对丹宁成分的显色反应中，丹宁能与氯化铁和氢氧化钠的混合试剂发生反应，呈现出蓝绿色。但显色结果表明卵叶远志根茎中的圆状颗粒未出现颜色变化，因此排除了丹宁类成分的可能。

图4 根茎内含物的组织化学定位Fig. 4 The histochemical localization of inclusions

注：A．卵叶远志根茎中皂苷的分布；B．细叶远志根茎中皂苷的分布；C．苏丹Ⅲ染色后的卵叶远志根茎；D．细叶远志根茎中的油滴分布；E．碘—碘化钾染色后的卵叶远志根茎；Od．油滴；X．圆状颗粒

3 结论与讨论

3.1 远志根茎结构特点

根茎为远志的主要药用部位，根茎结构是阐明其组织化学定位的基础，通过对细叶远志和卵叶远志根茎结构比较观察，发现它们基本结构相同，都是由周皮和次生维管组织构成。周皮外方为排列紧密的木栓层，内方栓内层细胞发达，细胞壁呈不均匀加厚，为主要细胞类型，经检测远志栓内层细胞内贮藏有丰富的皂苷、油脂类物质。次生维管组织包括次生木质部、维管形成层及次生韧皮部。靠近栓内层的韧皮薄壁细胞体积较大，靠近木质部的韧皮薄壁细胞体积较小，细胞壁加厚不明显。根茎中央次生木质部导管发达，因而都具有较强的抗旱能力。

细叶远志和卵叶远志二者根茎结构的主要不同之处在于：(1)细叶远志根茎长而粗壮，木芯比例小；(2)细叶远志的根茎中存在油脂滴，而卵叶远志根茎中无油脂滴存在；(3)细叶远志根茎中次生木质部的外方呈不规则芒齿状向外发散，卵叶远志根茎的次生木质部呈圆环排列；(4)经番红-固绿染色后的卵叶远志根茎，其栓内层细胞内分布有大量的紫红色圆状颗粒，通过组织化学显色，初步判定为蛋白颗粒，而细叶远志根茎中未发现有紫红色圆状颗粒。以上鉴别特征均可为市售远志的商品鉴别及质量控制提供依据。

3.2 远志根茎中的年轮结构

远志根茎周皮中的木栓层细胞通常为4～10层，未随时间呈现规律性递增，无法通过木栓层细胞计数而判定远志生长年限[15]。但在远志根茎的横切面中，发现次生木质部中的年轮纹结构特征明显，每年会形成两个生长层。年轮的产生是形成层每年季节性活动的结果，结合远志的生物学习性，在一年的生长周期中，第一个生长层形成于春季至盛夏(每年4月上旬至7月中旬)。当春季温度逐渐升高，进入返青期，远志形成层细胞解除休眠并恢复分裂能力，形成层活动旺盛、细胞分裂快，形成的木质部细胞孔径大而壁薄。当转入盛夏时，随着环境中水分减少，远志由营养生长逐渐转入生殖生长，根茎的形成层细胞平周分裂减慢，进入了夏眠期[10]。第二个生长层发生于夏末至冬末(每年8月初至次年3月初)，当秋季气温降低，雨水充沛，达到种子萌发的最适条件时，远志生殖生长停止，全面进入第二轮营养生长。待入冬后远志地上部分枯萎，地下部分逐步进入休眠，所形成的木质部细胞体积小，导管孔径小，因而前一年的晚材和后一年的早材之间形成了明显的年轮线。本研究结果与药农播种习惯一致，因此可通过计数远志木质部生长层数来鉴别远志药材的生长年限。

3.3 卵叶远志生长节律分析

药材栽培种植收益的评价依据主要为药材的产量和质量。传统认为，抽去木芯的远志筒质优且价格最高，因此根皮份额比成为远志药材质量评价的关键因素[13]。通过对不同种植年限卵叶远志农艺性状比较研究，发现卵叶远志根茎的纵向发育主要在第一年完成，与1a生卵叶远志相比，2a生卵叶远志的根茎长增幅较小，根茎重增幅28.2%，根冠比为0.16，表明第二年生长期内卵叶远志主要进行地上部分发育与根茎的横向增粗。进入第三年生长期后，卵叶远志产量比第二年提高约1.5倍，且3a生卵叶远志的根皮份额比达到了95%，超过了细叶远志根皮比，药材产量增幅显著。因此，综合卵叶远志根茎生长节律特点，3a生卵叶远志药材经济产量最高。