西红花苷生物合成途径研究进展

叶 军，张 翔，朱睿睿，赵玉成，谢国勇，秦民坚

(中国药科大学 中药学院，江苏 南京 211198)

西红花苷又名番红花苷、藏红花苷或藏红花素，属于脱辅基类胡萝卜素类化合物，具有抗动脉粥样硬化、抗高血压、降血脂、抗氧化、抗抑郁、抗癌、抗炎等药理活性。西红花苷以玉米黄质为直接前体，通过类胡萝卜素裂解双加氧酶、醛脱氢酶和糖基转移酶等步骤的催化反应，得到各种西红花苷类化合物。西红花苷生物合成途径还可以上溯到类胡萝卜素合成途径和萜类合成途径。本文对西红花苷生物合成路径以及该通路相关酶基因的研究现状进行综述，为解析西红花苷生物合成途径及相关酶基因提供理论依据，为进一步利用代谢工程生产或提高西红花苷类提供有利基础，以扩大含西红花苷类植物的开发利用。

1 西红花苷的生物合成

1.1 西红花苷类

西红花苷类成分是名贵药材西红花的主要活性物质，属于类胡萝卜素物质，也来源于茜草科植物栀子的成熟果实和马钱科植物密蒙花的盛开花[1-2]。西红花苷是一种天然存在的二萜类成分，主要由西红花苷-1～西红花苷-5等化合物组成，有着巨大的利用价值。西红花苷对多种中枢神经系统和心血管系统疾病具有良好疗效[3]，如有研究表明西红花苷对阿尔兹海默症、帕金森、抑郁症、癫痫、高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化都有一定的疗效。同时还具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保护肝脏、抗肺和肾纤维化等作用[4-5]。此外，长期以来还被用作染料、香料和食品添加剂等。据现有文献报道，西红花苷类成分在植物界的分布较窄，仅在西红花、山栀子、水栀子、密蒙花、夜花、牛蒡、蔓生百部、含羞草等植物中发现[6]。目前西红花苷的制备主要依赖于西红花[7]、栀子[8]、密蒙花[9]等植物中提取、纯化，但是提取需要大量的有机溶剂和药材，并且最终的得率和纯度并不高。有人通过化学合成的方法研究生产西红花苷[10]，但是化学合成法存在工艺流程复杂、反应条件苛刻、成本高、有毒有害试剂易污染环境等问题。缺乏可用性一直是限制西红花苷类化合物广泛应用的主要因素。因此，开发更经济、更环保的生产西红花苷类物质的方法(如代谢工程)是很有必要的。

1.2 西红花苷的生物合成途径

西红花苷类化合物是植物类胡萝卜素合成途径下游——西红花苷合成途径的产物。西红花苷合成途径目前仅在鸢尾科、茜草科、马钱科植物中有相关的研究。综合前人的研究，推测西红花苷类化合物的合成路径如图1所示。西红花苷的合成起始于由类胡萝卜素合成过程中形成的中间形态玉米黄质(Zeaxanthin)，经类胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)的氧化裂解作用生成2个β-环柠檬醛(β-Cyclocitral)分子和1个藏花酸二醛(Crocetin dialdehyde)分子[11]。此后，藏花酸二醛在醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)的催化下脱氢氧化生成藏花酸(Crocetin)[12]，再经过一系列的UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)的糖苷化作用，形成各种水溶性色素，即西红花苷类化合物(Crocin-1～Crocin-5)[13]。而β-环柠檬醛则先经UGT的作用转化成藏红花苦素(Picrocrocin)，后在β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，β-GS)和温度的共同作用下生成藏花醛(Safranal)。

图1 西红花苷生物合成途径Fig. 1 The biosynthetic pathway of crocinl

西红花苷类合成途径可以上溯到萜类合成途径。萜类合成途径是植物中最重要的次生代谢途径之一，由该途径直接或间接产生的以异戊二烯作为基本骨架单元的类萜化合物在天然产物中属于数量较多的一类[14]，如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、西红花苷等在植物生长发育中发挥重要作用。异戊烯基焦磷酸(Isopentenyl diphosphate, IPP)和其异构体二甲基丙烯焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)是萜类化合物的共同前体。如图2所示，IPP和DMAPP的合成因所处位置的不同而有两种途径：甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)途径和甲基赤藓醇磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途径[15]。在细胞质和内质网中，MVA途径首先是由3个乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)在乙酰乙酰CoA转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase, AACT)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutary-CoA synthase, HMGCS)和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutary-CoA reductase, HMGCR)催化下依次发生缩合、还原反应，形成6个碳原子的MVA[16]。随后，甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase, MK)和甲羟戊酸磷酸激酶(Mevalonate-5-phosphate- kinase, PMK)依次催化MVA发生两步磷酸化反应生成焦磷酸甲羟戊酸(Mevalonate-5-diphosphate, MVAPP)。最后，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase, MVD)将MVAPP脱羧转化成IPP[17]。而在质体中产生IPP和DMAPP并不需要MVA，而是以甘油醛-3-磷酸(D-Glyceraldehyde-3-phosphate)和丙酮酸(Pyruvate)作为起始反应底物，经MEP途径中的第一个限速酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS)催化生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate, DXP)。DXP再被1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductase, DXR)催化发生原子重排和还原反应生成MEP[18]，这是MEP途径中最重要的限速反应。最后，MEP通过缩合、磷酸化、羟基化、还原等反应转化生成IPP和DMAPP[19]。

图2 萜类合成途径及类胡萝卜素合成途径Fig. 2 The biosynthetic pathway of terpenoid and carotenoid

萜类骨架的生物合成主要是由IPP和DMAPP头尾相连，经过一系列酶促反应生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)[20]。GGPP 是类胡萝卜素类化合物的直接前体，通过八氢番茄红素合酶(Phytoene synthase, PSY)的二聚作用生成第一个类胡萝卜素15-顺式-八氢番茄红素(15-cis-Phytoene)，然后经过八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase, ZDS)的氧化脱氢作用和15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(15-cis-ζ-Carotene isomerase, ZISO)、类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase, CRTISO)的顺反异构作用生成全反式番茄红素(All-trans-lycopene)[21-24]。全反式番茄红素是类胡萝卜素合成途径的一个重要分支点[25]，先经过不同类型的番茄红素环化酶作用转化成α-胡萝卜素或β-胡萝卜素，再进一步被不同类型的羟化酶分别修饰成叶黄素(Lutein)和玉米黄质。从通路中可知，玉米黄质是西红花苷生物合成的重要直接前体物质，西红花苷类化合物的生物合成由此进一步展开。

2 西红花苷生物合成途径中的相关酶

随着高通量测序技术和分子生物学技术的发展，药用植物中活性成分的分子机制、生物合成、转运和调控等逐渐成为研究热点。伴随着多个与西红花苷类相关物种基因组、转录组序列的公布，越来越多编码CCD、ALDH、UGT以及该通路上游各种重要酶的基因被鉴定出来。利用生物工程技术调控这些基因的表达，可以直接影响增强或改变所需要的植物代谢物群，尤其是新化合物的产生。

2.1 CCDs

CCDs是参与西红花苷类化合物生物合成过程中的限速酶，是将类胡萝卜素合成途径的中间产物玉米黄质引向西红花苷合成的关键酶。自从2003年Bouvier等[26]最早提出CsZCD是对称裂解玉米黄质7、8或7’、8’位双键生成西红花苷的前体藏花酸二醛的关键酶以来，围绕西红花苷CCD基因的一系列研究工作逐渐展开。CsCCD4a、CsCCD4b是一对同工酶，它们的表达水平与柱头发育过程中β-紫罗酮的积累相关。有趣的是，CsCCD4a、CsCCD4b和CsZCD的相似性分别高达100%和98%，然而，Rubio等[27]并未能克隆出CsZCD基因，且成功克隆表达出的与CsZCD极其相似的CsCCD4a-211也没有裂解玉米黄质的活性。CsCCD4a-211和CsZCD在双加氧酶活性方面可能缺乏重要残基和结构域[28]。因此，研究者提出CsZCD的结构和催化活性需要重新考虑。随后，Frusciante等[29]发现了一种新的CCD酶-CsCCD2，它在柱头发育早期表达，与藏花酸形成的时间一致。通过氨基酸序列比对分析，发现CsCCD2是与CCD1家族相近但又不同的新分支。进一步研究表明，ZCD酶是CCD4酶的N-截断形式，是由一个5’端截短的CCD4转录本编码，但该转录本与CCD4a和CCD4b都不相同。玉米胚乳的体内瞬时表达和体外验证实验均证实CsZCD缺乏裂解活性，而CsCCD2可以通过在7、8和7’、8’位置的两步连续裂解反应将玉米黄质转化为藏花酸二醛和3-羟基-β-环柠檬醛。然而在2016年的一项研究中，Ahrazem等[30]表明CsCCD2并不是一个全长酶，新鉴定的cDNA被命名为CsCCD2L，其产物比CsCCD2多60个氨基酸，同时也证实了CsCCD2和CsCCD2L一样的质体定位。此外，通过大肠杆菌和水稻基因功能鉴定系统也验证了CsCCD2的同源酶黄金西红花CaCCD2的活性。

综上，CsCCD2可以确定为编码产生藏花酸的酶，对其在植物中的表达和调控机制也有许多研究。有文献报道，转录因子结合位点负责共同调控基因的表达，几种参与光、温度和生理调节反应的调控元件已确定位于CsCCD2基因的启动子区域[31]。Ahrazem等[32]通过序列比对确定了CsCCD2的外显子/内含子拼接边界、外显子和内含子大小以及内含子的位置，发现了3个不同的CsCCD2基因。CsCCD2a是最长的基因，包含9个内含子和10个外显子，其次是CsCCD2b，包含9个外显子和8个内含子。第三个是CsCCD2-t基因，不含内含子并缺失一个外显子。因此，Ahrazem等认为在CsCCD2转录本中可能存在选择性剪接或内含子保留[32]，这证实了一些报道中CCD2、CCD4同源酶没有活性的结果。

CCD酶活性位点结构相对较小的改变都可能产生显著的构象变化，包括底物结合囊和酶活性，进而影响底物的识别和定位。从不同CCD酶的晶体结构分析中可以看出，CCD4酶的底物识别和双键靶的选择可能与疏水性底物通道的大小及其与疏水性残基和芳香残基的相互作用有关[33]。疏水通道也存在于其他许多酶中，但这些通道的功能意义尚未被阐明。与BdCCD1相比，BdCCD4中发现了更多的疏水通道，而BdCCD4.1和BdCCD4.3裂解玉米黄质的能力表明，这些酶具有比BdCCD4.2更宽的底物通道，BdCCD4.2因含有两个脯氨酸残基而与玉米黄质形成空间障碍[34]，所以会阻碍底物通路和裂解能力。

2.2 ALDHs

ALDHs是以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADP+)作为辅因子将醛类转化为相应的羧酸类的氧化还原酶，是一类多功能蛋白，通常参与植物不同的过程，如糖酵解、糖原异生、细胞氧化还原平衡维持、植物防御和非生物应激反应等[35]。目前对藏花酸二醛进行氧化修饰的基因研究并不多。根据化学成分与生物合成基因表达的一致性，一些学者从不同植物的转录组数据分析中筛选或分离得到ALDH酶基因。Ji等[36]对栀子的叶子、绿色果实和红色果实进行了转录组分析，发现GjALDH12和GjALDH14在果实中高表达，这与西红花苷在在栀子中的分布保持一致，进一步通过系统发育分析和基因表达谱推测GjALDH12和GjALDH14参与了西红花苷的合成。ALDH1、ALDH2、ALDH3也被预测为编码ALDH酶的候选基因，Tan等[37]将CsCCD2和CsALDH基因引入产生玉米黄质的酿酒酵母中构建了新的表达菌株，只有CsALDH3能够战胜内源性的ALDHs，其藏花酸量显著增加了39%，表明候选CsALDH3可能是产生藏花酸的酶。最近一项研究中对四个ALDHs在不同组织中的表达和其催化活性进行了分析，并通过结构建模和对接计算以确定它们的特异性[38]。结果显示，ALDH11637和ALDH20158是柱头特异性表达的，但所有的ALDHs都能将藏花酸二醛转化为藏花酸。结构建模和对接分析表明，四个ALDH酶的构象都非常接近，它们和藏花酸二醛的亲和性都不高。通过系统发育分析和结合亲和力的计算，推测ALDH2C4家庭成员可能参与藏花酸二醛转换成藏花酸的过程且具有较高特异性。

基于蛋白质组学数据，一些ALDHs被认为存在于质体中[39],包括CsADHComp54788，这是一种截短的CsALDH3I1形式，缺乏羧基末端的疏水结构域可能是介导内质网定位的媒介。Demurtas等[40]确定了CsALDH3I1能将藏花酸二醛转化成顺式/反式藏花酸，并通过烟草叶片的共聚焦荧光实验确定了CsALDH3I1位于内质网。CsALDH3I1和真菌胡萝卜醛脱氢酶YLO-1都含有一个C-端跨膜结构域，该跨膜区的两侧是富含碱性氨基酸的序列，通过非结构域与ALDH酶主链相连[41]。该结构域介导了YLO-1与细胞内膜的结合，进一步支持CsALDH3I1翻译靶向内质网的假说。总之，虽然许多CsALDH酶与Gomez-Gomez等[39]鉴定的酶高度相似，但没有一种CsALDH酶在烟草叶片中显示出质体定位。可见，ALDH酶可能是在内质网上对藏花酸二醛发挥活性作用。

2.3 UGTs

西红花苷生物合成的最后一步是将糖分子附着到特定受体上，该过程通常是由介导次生代谢物、外源性生物和激素的糖基化UGTs催化而成[42]。糖基化作用可为色素增加水溶性和稳定性，从而提高了其生物利用度和药用价值。

从藏花酸到西红花苷的糖基化过程不是由单个基因调控，而是涉及多个UGT酶基因和步骤。早在1997年，Dufresne等[43]通过西红花愈伤组织酶提取物对藏花酸进行了糖基化酶促反应，依次催化出西红花苷-5、西红花苷-4、西红花苷-3、西红花苷-2和西红花苷-1。结合两种类型的酶反应动力学研究，他们推测西红花苷生物合成过程中可能存在两种糖基转移酶。随之，研究者们发现GTASE1[44]、CsUGT74AD1[40]对藏花酸具有高度特异性，催化生成西红花苷-5和西红花苷-3，而对其他结构相似的底物无活性。同样在栀子中，Nagatoshi等[45]借助于转录组数据，结合表达量筛选出GjUGT75L6和GjUGT94E5基因：GjUGT75L6负责藏花酸羧基的糖基化作用，催化生成西红花苷-5和西红花苷-3；GjUGT94E5负责藏花酸葡萄糖基酯的6’位羟基的糖基化作用，可以催化西红花苷-5、西红花苷-3和西红花苷-2，分别生成西红花苷-4、西红花苷-2和西红花苷-1，进一步佐证了藏花酸糖基化过程的多样性。

然而，双酶活性具体如何调节有待深入研究。当底物西红花苷-5在0.2 mM以上时，UGT94E5的活性被抑制，而底物西红花苷-3中则未观察到这种底物抑制现象，因此该学者推测大多数西红花苷-5不是转化为西红花苷-4，而是转化为西红花苷-3，然后西红花苷-3迅速发生糖基化反应，最终生成西红花苷-1[45]。也有研究表明UGT酶可能具有组织或细胞特异性。Moraga等[46]通过体外催化实验证实UGTCs2对藏花酸、西红花苷-5和西红花苷-4具有糖基化活性，可是催化产物的极性比西红花苷-1大得多。他们认为出现这种结果的原因可能有两种：一是该催化产物是未知的新色素，二是UGTCs2是重组酶，在植物体外与在体内的催化特性并不完全相同。

此外，Demurtas等[40]通过CsUGT74AD1的免疫印迹分析，表明该酶定位于细胞质中的电子致密结构，如膜或细胞骨架，共聚焦显微镜也证实该蛋白与细胞质标记物mCherry在烟草叶片中的共定位。这种定位与大多数植物UGT酶的胞质定位一致[47]。Ahrazem等[48]也发现UGT74AD2具有类似于UGT74AD1靶向细胞质的N-端信号肽。而UGTCs2[46]有一个N端疏水域结构，可见其在植物体内可能与膜结构有关。实际上，糖基化作用为膜结合转运蛋白和代谢产物从细胞质转移运输到其他结构中提供了通道，如到细胞壁或液泡中[49]。

2.4 其他基因

Castillo等[50]克隆了CsPSY、CsPDS、CsLYC-β，并分离出两个β-胡萝卜素羟化酶。CsBCH基因参与了藏红花柱头中类胡萝卜素的生物合成过程，有报道显示其具有节律性的表达模式，在凌晨2点到下午1点之间波动表达，相差达到1.4倍[32]。Ahrazem等[31]发现CstLcyB2a只在柱头表达，其编码蛋白的表达增加了β-胡萝卜素的含量。此外，CsLYC-β，CsBCH和CsGT2的表达谱在花的不同部位以及柱头的不同发育时期也有报道研究[51-52]，其中，CsLYC-β在不同发育时期柱头的实时荧光定量PCR分析中出现一个明显增加，表明它在类胡萝卜素裂解化合物和植物发育中的潜在调控作用。

3 结语

西红花苷因其具有良好的药理活性和经济价值，目前对于西红花苷类生物合成涉及到的上游途径——萜类合成途径和类胡萝卜素合成途径的研究已经比较清楚，但从玉米黄质转入西红花苷合成这一步开始的下游合成途径有待深入研究，很多CCD、ALDH、UGT的功能尚未明确。利用分子生物学方法研究植物次生代谢调控机制，借助生物工程技术生产或提高植物有效活性成分含量，是现代中药及植物研究的热点和趋势。近年来多个西红花、栀子等组学数据的报道以及相关酶基因的研究，为西红花苷类化合物的生物调控机制和代谢工程提供了分子基础。