长链非编码RNA LOC554202作为内源竞争RNA调控微小RNA-98-5p在卵巢癌顺铂化疗敏感性中的作用

鲁笑钦，王志红，付美洲，王 琪，王利君，李元昆

(1.郑州大学第二附属医院妇产科，河南 郑州 450014；2.河南省人民医院教育培训部，河南 郑州 450003)

卵巢癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌，在女性生殖系统恶性肿瘤中居第2位，但病死率居首位[1-2]。手术联合化疗是卵巢癌患者的主要治疗方式，化疗耐药是导致复发的重要因素。顺铂(DDP)在卵巢癌化疗方案中极其重要，引起卵巢癌DDP耐药的原因尚未完全明确。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)通过作为内源竞争RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)在卵巢癌DDP耐药中起重要作用。本研究将对lncRNA LOC554202作为ceRNA调控微小RNA(micro RNA,miR)-98-5p在卵巢癌DDP耐药中的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料人卵巢癌细胞系A2780、人胚胎肾细胞系293T(美国ATCC细胞库)，注射用DDP(山东齐鲁制药有限公司)，RNA提取Trizol试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green 1荧光染料试剂盒(日本TaKaRa 公司)，双荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)，引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)，慢病毒包装试剂盒、LipofectamineTM 3000试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，细胞计数试剂盒(CCK-8，日本同仁化学研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 双荧光素酶检测实验 利用在线靶基因预测工具TargetScan (http://www.targetscan.org/)预测LOC554202与miR-98-5p存在的结合位点。利用双荧光素酶检测实验验证两者的靶向关系。LOC554202序列片段(LOC554202-WT、LOC554202-MUT)构建荧光素酶报告基因载体pGL4.17。采用lipofectamineTM 3000 将LOC554202-WT或LOC554202-MUT与miR-98-5p-NC或miR-98-5p mimics共转染293T细胞，按双荧光素酶检测实验试剂盒说明书操作，检测荧光素酶的荧光活性。

1.2.2 过表达和敲降LOC554202 利用对数生长期的A2780细胞株和DDP耐药的A2780(A2780/DDP)细胞株，未转染组细胞常规培养，其余分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOC554202，定量PCR(quantitative PCR，qPCR)检测细胞中miR-98-5p的表达。利用对数生长期的A2780细胞株和A2780/DDP细胞株，未转染组细胞常规培养，其余分别转染siRNA-NC和siRNA-LOC554202，qPCR检测细胞中miR-98-5p的表达。

1.2.3 qPCR实验 Trizol抽提总RNA。逆转录合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)：20 μL反应体系。反应条件：42 ℃，1 h；95 ℃，灭活10 min；冰浴5 min；cDNA保存于-20 ℃备用。根据从GenBank中查得的基因序列用Primer Design 软件设计引物序列如下：LOC554202，F：5’-TCTCTGGTGCTTCCCTCCTT-3’，R：5’-GATCTAAGCTTGAGCCCCCA-3’；miR-98-5p，F:5’-CACCGCAGAAGCGGCACTTTATAAGCGAACT-3’，R:5’-TTATAAAGTGCCGCTTCTGCTTATAAGTTCGC-3’; U6，F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R:5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；β-actin，F：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，R：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。扩增条件：25 μL反应体系，94 ℃，2 min，预变性；94 ℃，30 s，变性；58 ℃，30 s，复性；72 ℃，40 s，延伸；共进行40个循环。设定每个循环退火期结束后程序自动记录该循环的荧光值。qPCR实验均重复3次。

1.2.4 CCK-8实验 制备细胞悬液，细胞计数，96孔板中接种细胞后，置于37 ℃培养箱中。每孔加入10 μL CCK8溶液。将培养板在培养箱内继续孵育2 h，用酶标仪测定波长450 nm处的光密度值(OD450)。CCK-8实验均重复3次。

2 结果

2.1 双荧光素酶检测实验验证LOC554202和miR-98-5p的靶向关系生物信息学预测LOC554202和miR-98-5p存在靶向结合位点(图1)。LOC554202-wt +miR-NC mimic组、LOC554202-WT +miR-98-5p mimic组、LOC554202-MUT +miR-NC mimic组、LOC554202-MUT +miR-98-5p mimic组荧光活素酶活性值分别为2.608±0.287、1.884±0.067、3.152±0.260、3.051±0.166，总体比较差异有统计学意义(F=23.365，P<0.001)。两两比较示，LOC554202-WT +miR-nc mimic组和LOC554202-WT +miR-98-5p mimic组比较差异有统计学意义(P<0.05)。这提示过表达miR-98-5p后，LOC554202荧光素酶活性显著下调；LOC554202突变后荧光素酶活性下调作用消失，证实了miR-98-5p与LOC554202存在相互作用。

图1 生物信息学分析预测 LOC554202和miR-98-5p靶向结合位点

2.2 LOC554202和miR-98-5p在A2780细胞株和A2780/DDP细胞株中的表达LOC554202在A2780/DDP细胞株中的相对表达量为0.509±0.032，低于A2780细胞株的1.001±0.054，比较差异有统计学意义(t=13.505，P<0.001)。miR-98-5p在A2780/DDP细胞株中相对表达量为2.184±0.076，高于A2780细胞株的1.001±0.048，比较差异有统计学意义(t=22.720，P<0.001)。见图2、3。

图2 LOC554202在不同细胞株中的表达

A2780细胞株和A2780/DDP细胞株比较，t=13.505，P<0.001

图3 miR-98-5p在不同细胞株中的表达

A2780细胞株和A2780/DDP细胞株比较，t=22.720，P<0.001

2.3 过表达或敲降LOC554202对A2780细胞株miR-98-5p表达的影响pcDNA3.1-LOC554202组A2780细胞株LOC554202相对表达量为1.902±0.060，高于pcDNA3.1组的1.001±0.051，比较差异有统计学意义(t=19.874，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202组A2780细胞株miR-98-5p相对表达量为0.635±0.033，低于pcDNA3.1组的1.001±0.064，比较差异有统计学意义(t=8.863，P=0.001)；提示LOC554202过表达后，A2780细胞株中LOC554202相对表达量显著上调，而miR-98-5p相对表达量显著下调。siRNA-LOC554202组A2780细胞株LOC554202相对表达量为0.563±0.057，低于siRNA-NC组的1.000±0.021，比较差异有统计学意义(t=12.516，P<0.001)；siRNA-LOC554202组A2780细胞株miR-98-5p相对表达量为1.472±0.088，高于siRNA-NC组的1.001±0.042，比较差异有统计学意义(t=8.834，P=0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780细胞株中LOC554202相对表达量显著下调，miR-98-5p相对表达量显著上调。见图4、5。

图4 过表达或敲降LOC554202对 A2780细胞株中LOC554202表达的影响

pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LOC554202组比较，t=12.516，P<0.001；siRNA-NC组和siRNA- LOC554202组比较，t=8.863，P=0.001

2.4 过表达或敲降LOC554202对A2780/DDP细胞株miR-98-5表达的影响pcDNA3.1-LOC554202组A2780/DDP细胞株LOC554202相对表达量为2.411±0.193，高于pcDNA3.1组的1.001±0.064，比较差异有统计学意义(t=12.016，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202组A2780/DDP细胞株miR-98-5p相对表达量为0.620±0.058，低于pcDNA3.1组的1.001±0.049，比较差异有统计学意义(t=8.683，P=0.001)；提示LOC554202过表达后，A2780/DDP细胞株中LOC554202相对表达量显著上调，而miR-98-5p相对表达量显著下调。siRNA-LOC554202组A2780/DDP细胞株LOC554202相对表达量为0.432±0.012，低于siRNA-NC组的1.000±0.035，比较差异有统计学意义(t=26.545，P<0.001)；siRNA-LOC554202组A2780/DDP细胞株miR-98-5p相对表达量为1.499±0.057，高于siRNA-NC组的1.000±0.036，比较差异有统计学意义(t=12.723，P<0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780/DDP细胞株中LOC554202相对表达量显著下调，miR-98-5p相对表达量显著上调。见图6、7。

图5 过表达或敲降LOC554202对 A2780细胞株中miR-98-5p表达的影响

pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LOC554202组比较，t=19.874，P<0.001；siRNA-NC组和siRNA- LOC554202组比较，t=8.834，P=0.001

2.5 LOC554202对A2780细胞株和A2780/DDP细胞株增殖的影响对于A2780细胞株和A2780/DDP细胞株，LOC554202过表达均可显著抑制细胞增殖(F=112.060，P<0.001；F=74.988，P<0.001)，而LOC554202敲降均可显著促进细胞增殖(F=39.842，P<0.001；F=34.087，P<0.001)。见图8。

2.6 LOC554202对A2780细胞株和A2780/DDP细胞株IC50的影响对于A2780细胞株和A2780/DDP细胞株，LOC554202过表达均可显著降低细胞的IC50，而LOC554202敲降均可显著提升细胞的IC50。见图9。

3 讨论

卵巢癌恶性程度高，起病隐匿，大多数被发现时已处于临床Ⅲ～Ⅳ期。卵巢癌细胞减灭术和铂类联合紫杉醇化疗是晚期卵巢癌患者的标准治疗方案，但超过25%的患者会发生对铂类的耐药，并且部分耐药患者对后续铂类化疗方案的反应性不足30%[2-3]。

图6 过表达或敲降LOC554202对 A2780/DDP细胞株中LOC554202表达的影响

pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LOC554202组比较，t=12.016，P<0.001；siRNA-NC组和siRNA- LOC554202组比较，t=26.545，P<0.001

图7 过表达或敲降LOC554202对 A2780/DDP细胞株中miR-98-5p相对表达量的影响

pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LOC554202组比较，t=8.683，P=0.001；siRNA-NC组和siRNA- LOC554202组比较，t=12.723，P<0.001

编码lncRNA LOC554202的基因位于9p21.3。在不同肿瘤组织中，LOC554202可表现为癌基因或抑癌基因的作用[4]。LOC554202在胃癌细胞中过表达，可能通过下调p21和E-cadherin的表达水平促进胃癌增殖和迁移[5]。敲降LOC554202会降低乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并在体外抑制迁移或侵袭，在体内抑制肿瘤发生[6]。高水平的LOC554202预示宫颈癌预后不良[7]。LOC554202在直肠癌中低表达，并与病理分期和肿瘤大小密切相关；其过表达在体外降低细胞增殖、诱导细胞凋亡，并在体内阻碍了肿瘤的发生[8]。LOC554202通过上调miR-31表达促进非小细胞肺癌的获得性吉非替尼耐药[4]。过表达的LOC554202提示奥沙利铂治疗的结直肠癌患者预后良好[9]。

图8 LOC554202对A2780细胞株和A2780/DDP细胞株增殖的影响

图9 LOC554202对A2780细胞株和A2780/DDP细胞株IC50的影响

miR-98-5p属于let-7家族成员。miR-98-5p在乳腺癌中起抑癌作用[10]。LncRNA SNHG4通过抑制miR-98-5p的表达促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化[11]。HEIH可以通过miR-98-5p/HECTD4轴促进胆管细胞癌的发生和发展[12]。miR-98-5p可通过天冬酰胺连接的糖基化3对非小细胞肺癌起到负调控的作用[13]。miR-98-5p的过表达与卵巢上皮性癌患者的DDP耐药性和不良预后有关，其过表达显著增强卵巢上皮性癌对DDP治疗的耐药性[14]。携带成纤维细胞驱动的外泌体携带过表达的miR-98-5p，可通过下调p21细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂1A促进卵巢癌对DDP的耐药[15]。

本研究结果显示:相较于A2780细胞株，A2780/DDP细胞株中LOC554202呈低表达，miR-98-5p呈过表达。说明LOC554202和miR-98-5p可能与卵巢癌DDP耐药相关。随后进行的生物信息学分析和实验证实LOC554202是miR-98-5p的靶标。在A2780细胞株和A2780/DDP细胞株中，LOC554202的过表达和敲降均会导致miR-98-5p相对表达量的显著下调和上调，并可影响细胞的增殖能力和耐药。这说明无论在A2780细胞株中，还是在A2780/DDP细胞株中，LOC554202均可通过ceRNA调控miR-98-5p的表达，且LOC554202均可显著影响细胞的增殖和耐药。

综上所述，lncRNA LOC554202和miR-98-5p可能与卵巢癌DDP耐药相关，LOC554202可通过ceRNA调控miR-98-5p的表达，调控卵巢癌DDP化疗的耐药。