超微粉技术制备破壁灵芝孢子粉试验

杨杰仲 魏善元 陈 旭 朱森林 杨 珍 杜慕云 杨仁德*

（1贵州省中药材现代化研究所，贵州贵阳550006；2贵州省土壤肥料研究所，贵州贵阳550006）

灵芝（Ganoderma lingzhi）是担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属真菌[1]。《中华人民共和国药典》（2015年版）记载，赤芝和紫芝具有补气安神，止咳平喘功效；主治眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘[2]。药理研究证明，灵芝及其有效成分具有免疫调节、抗肿瘤、保护放化疗损伤、镇静和镇痛、强心与抗心肌缺血、抗脑缺氧、抑制血管紧张素转化酶活性、抑制胆固醇合成及调节血脂、降血糖、抑制血小板凝集、增强DNA多聚酶活性、促进核酸和蛋白质合成、提高缺氧耐受力、抗氧化清除自由基、抗衰老等作用[3]。灵芝孢子是灵芝生长发育后期产生的种子，是灵芝的精华。灵芝孢子有一层极难被人体消化的由几丁质构成的外壁，未破壁的孢子粉的有效成分人体利用率低，只有打开这层外壁，有效成分才能充分释放被人体吸收利用。超微粉碎技术是一种将各种固体物质粉碎成直径小于10µm粉体的高科技工业技术，是近20年来迅速发展形成的一种新技术，这一技术以最大限度细胞破壁为目的。采用超微粉碎技术，使灵芝孢子在粉碎过程中，受到强烈的正向挤压力和切向剪切力，细胞被挤压、剪切，细胞壁被撕裂，细胞被破碎成碎片或者被压破，细胞内的有效成分直接暴露出来，加速有效成分的浸出，促进溶解和吸收，从而提高生物利用率。试验旨在明确用超微粉碎技术制备破壁灵芝孢子粉相关参数，以获得好的破壁效果。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

灵芝孢子粉，为赤灵芝孢子粉，由贵州星原生物科技有限公司生产基地提供；蒽酮、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。

超微粉碎机，烟台慧宝设备制造有限公司；Nicomp 380 ZLS激光纳米粒度测定仪，美国Particle Sizing Systems公司；显微镜XS-212-201型、CT6T台式多用途离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝孢子粉超微粉碎单因素试验

选取对孢子破壁率有直接影响的两个因素，即粉碎机转速和粉碎时间，计算不同条件下灵芝孢子的破壁率，以确定最佳破壁条件。

1.2.2 灵芝孢子破壁前后扫描电镜观察

取少量干燥破壁和未破壁孢子粉，分别在扫描电镜下扫描观察。

1.2.3 灵芝孢子破壁率的计算

1.2.3.1 孢子计数及标准曲线绘制

准 确 称 取 0.0 050 g、0.0 100 g、0.0 150 g、0.0 200 g、0.0 250 g、0.0 500 g、0.0 600 g、0.0 700 g未破壁灵芝孢子粉，分别置于容量瓶中，加适量蒸馏水，置于微波振荡器中充分震荡，打散孢子团，定容至刻度线，混匀。然后用血球计数板依次对该系列悬浮液中的孢子进行计数。按对角线法取5个大格为1个计数单位，每个浓度的孢子悬浮液取8个计数单位的平均值。最后以灵芝孢子粉称样量与每个计数单位孢子平均数做出标准曲线。

1.2.3.2 破壁率计算方法

精密称取一定量破壁孢子粉，用1.2.3.1中所述方法进行孢子计数，按下述公式进行破壁率的计算。

A=（Y-n）/Y×100%

图1 灵芝孢子粉破壁前后电镜扫描照片

式中：A为破壁率；Y为从标准曲线查得待测孢子粉的每个计数单位孢子平均数；n为用血球计数板测得每个浓度孢子悬浮液的计数单位孢子的平均数。

2 结果与分析

2.1 灵芝孢子破壁前后电镜图片比较

取少量干燥破壁和未破壁孢子粉，分别在扫描电镜下扫描观察。由电镜扫描图可看出，破壁前的灵芝孢子粉颗粒清晰能辨认，有坚硬的双层壁；经超微粉碎后，灵芝孢子粉颗粒不能辨认数数，孢子壁被全部打碎（图1），有效成分充分释放。

2.2 超微粉碎机转速、时间对破壁率的影响

超微粉碎机通过两个高速自转的粉碎环获得一种强大的离心力和剪切力破碎孢子粉壁（传统粉碎机粉碎介质得不到），影响破壁率的主要因素有粉碎机的主轴转速以及粉碎时间。

图1 超微粉碎机转速对破壁率的影响

由图1可以看出，随着主轴转速的提高，破壁率几乎是呈线性上升，转速越大，施加在主轴上剪切力和压缩力也随着增大，当转速达到2 200 r/min时，破壁率可以达到96%，而转速为2 300 r/min以上时，破壁率并无明显上升，所以破壁最佳转速选定为2 200 r/min。

图2 粉碎时间对破壁率的影响

由图2可以看出，破壁前20 min，破壁率上升显著，20 min以后，破壁率的上升比较缓慢。这是因为随着破壁时间的延长，未被粉碎的孢子越少，其与筒壁及粉碎环接触的概率下降，被粉碎的概率也相应下降，所以破壁20 min为最佳工作时间。

3 小结与讨论

试验结果表明，转速为2 200 r/min、粉碎时间为20 min时，灵芝孢子壁破壁效果好，破壁率可以达到96%。但孢子的破壁率达到96%后，就不再随转速和时间增加而提升，不能达到100%。这可能是由于孢子本身粒径太小，小于粉碎环和筒壁之间的最小间隙距离，使得总有少量的灵芝孢子未能受到足够的剪切力作用，从而孢子壁未被破坏。