HPLC-MS/MS法测定人尿液中纳洛酮、6-单乙酰吗啡的含量

摘 要：目的：通过对海洛因代谢物6-单乙酰吗啡及阿片类治疗药剂纳洛酮的色谱过程的筛选，分离两种物质且其线性、重复性、回收率满足要求。方法：利用液相色谱-串联质谱法，选择不同的色谱柱、色谱条件、前处理方法等，最后选出合适的条件对纳洛酮和6-单乙酰吗啡进行分离。结果：人尿液中纳洛酮与6-单乙酰吗啡可以得到有效分离。结论：HPLC-MS/MS法测定人血液中纳洛酮和6-单乙酰吗啡的含量，在2.5ng/mL-40ng/mL范围内的线性>0.995，组内偏差<10%，回收率为85%-98%

关键词：液质联用;纳洛酮;单乙酰吗啡;尿液

海洛因是国家禁止的第一代毒品，其在体内代谢成6-单乙酰吗啡作为吸食海洛因的标志物。然而在对阿片类中毒的患者治疗时，常常会使用纳洛酮作为解毒剂和治疗剂进行冲击治疗。纳洛酮和6-单乙酰吗啡是同分异构体，且结构接近。为排除干扰，本文通过对色谱条件，离子对的选择等方面进行试验和优化。

1 实验条件

1.1 设备与试药

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津），API4000三重四级杆质谱仪（AB SCIEX），湘仪高速离心机（HT16MM），BRAND移液器，纯水器（Millipore）。

6-单乙酰吗啡（批号：FE12131602，Cerilliant，含量1.018mg/mL），

纳洛酮（批号：FN05311602，Cerilliant，含量1.000mg/mL）

内标（批号：FE07061501，Cerilliant）

甲醇为色谱纯（Merk），甲酸為质谱级（Fisher），超纯水为自制的。

1.2 色谱柱

Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm×5μm）

Agilent XDB-C18（150mm×2.6mm×3.5μm）

1.3 质谱条件

质谱条件：质谱离子化方式为ESI+。

海洛因在人体内特征代谢产物6-单乙酰吗啡结构和纳洛酮的结构如下：

纳洛酮 6-单乙酰吗啡

单乙酰吗啡与纳洛酮的分子式均为：C19H21NO4，分子量均为327.37。利用LC-MS/MS进行方法优化过程中找到的特征离子对如下：

由上表看出，两种物质在相同质谱条件下，其碎片离子有较大的交叠区间。且通过观察，两种物质的DP能接近，且均非突变型DP变化，趋向性不明显。在同一条件下，其碎片离子会互相干扰。这也在后续的试验中得到证明。最后，选择的特征离子对如下：

在色谱柱选择时，首先采用通用的安捷伦XDB-C18发现目标物的峰型较差，且由于结构相似，两种物质较难进行分离。故而根据目标物的多环结构选择PFP五氟苯基柱，对类似的多环结构进行分离。

2 样品制备

2.1 空白样品

选取小牛血清1mL，加入10μL的地西泮--D5内标（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸钠缓冲液，混匀后加入3mL乙醚进行萃取。取乙醚层1.5mL水浴挥干（60℃）后加复溶液100μL溶解进样。

2.2 质控样品

选取小牛血清0.9mL，加入0.1mL已知浓度的标准目标物溶液，10μL的地西泮--D5内标（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸钠缓冲液，混匀后加入3mL乙醚进行萃取。取乙醚层1.5mL水浴挥干（60℃）后加复溶液100μL溶解进样。

2.3 样品

用移液器移取血液样本1mL，加入10μL的地西泮-D5内标（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸钠缓冲液，混匀后加入3mL乙醚进行萃取。取乙醚层1.5mL水浴挥干（60℃）后加复溶液100μL溶解进样。

将经调pH、涡旋萃取、富集复溶后，导入液相色谱--串联质谱联用仪中，利用母离子/定量离子对（237.0/ 194.1）响应值的峰面积与内标地西泮-D5的峰面积比，随其含量的增加成正比，与标准系列比较来进行定量分析。

3 参数调试

通过测试表明：当流速处于0.25mL/min-0.4mL/min时纳洛酮与单乙酰吗啡的分离效果不理想，单乙酰吗啡中存在未分离出的纳洛酮峰，纳洛酮中同样含有单乙酰吗啡的峰。最后会对判定结果造成干扰，导致假阳性或者假阴性的产生。当流速处于0.2mL/min时，两个色谱峰可以较完整的分离开，且内部包含的杂质目标峰可以分离。（见下图）。由实验测试结果确认色谱条件为：色谱柱：选用五氟苯基柱;流动相：72%乙腈的甲酸--乙酸铵水溶液（20mmol）。流速：0.2mL/min，进样体积为10μL。

3 结果

方法验证结果：

对该检测方法进行方法学验证结果如下：

4 分析与讨论

本文对血液中纳洛酮和海洛因的标志性代谢物6-单乙酰吗啡利用液相色谱串联质谱的检测方法进行测试，采用正离子MRM模式下，优化了色谱条件，将单乙酰吗啡和纳洛酮进行的有效的分离，避免检测结果出现假阳性或者假阴性。通过对目标物检出限、定量限、线性范围、精密度与准确度的测定，结果回收率：单乙酰吗啡与纳洛酮的回收率都在80%以上，120%以下。日内精密度与日间精密度分别小于5%和10%。表明该方法有较好的准确度和精密度。方法的线性良好，线性范围满足样本中分析物的检测要求。

作者简介：

钟济声（1986- ），男，本科，助理工程师，从事工作为法医毒物检测。