大豆蛋白热聚集体的溶液行为表征

王冬梅 范志军 安然 王中江

摘 要：研究不同热处理温度对大豆蛋白热聚集体溶液行为的影响。结果表明，随着热处理温度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集体，随着聚集体粒径和分子量的逐渐增大，浊度显著增加。60 ℃和80 ℃热诱导聚集体以单个分子颗粒形式存在，而100 ℃热诱导聚集体呈小尺寸粒子。

关键词：大豆蛋白;热处理温度;溶液行为

Abstract：The effect of different heat treatment temperature on the behavior of soybean protein thermal aggregate solution was studied. The results showed that with the increase of heat treatment temperature， the particle size and molecular weight of soybean protein increased gradually because of the formation of soluble aggregates. Turbidity increased significantly. Heat induced aggregates at 60 ℃ and 80 ℃ are in the form of single molecular particles， while heat induced aggregates at 100 ℃ are in the form of small particles.

Key words：Soybean protein; Heat treatment temperature; Solution behavior

通过加热使蛋白质变性并聚集在一起形成聚集体的现象称为蛋白质的热聚集行为，会引起蛋白质功能特性的变化[1]，空间结构变化，对功能特性和食品品质产生严重影响。由此可见，研究热处理温度对大豆蛋白热聚集行为的影响对于理解蛋白变性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆分离蛋白采购自山东万得福实业有限公司，蛋白质含量约92.11%。乙醇、NaOH等实验试剂均为分析纯。

1.2 实验设备

本实验所用仪器设备如表1所示。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白可溶性热聚集体的制备

先在大豆分离蛋白中加入10 mmol·L-1，pH为7.0的磷酸缓冲液，制成质量浓度为5%的样品溶液，然后在4 ℃下以9 000 r·min-1的速率离心处理30 min，取其上清液于带塞三角瓶中，而后在60、80、100 ℃条件下水浴处理30 min，在4 ℃下以9 000 r·min-1的速率离心处理30 min，取其上清液用0.45 ?m过滤膜过滤，经过干燥后，在4 ℃下储存即可。

1.3.2 动态光散射

测定蛋白质粒径常采用Zetasizer Nano ZS纳米粒度分布仪。利用pH为7.0、浓度为10 mmol·L-1的磷酸缓冲液将样品蛋白稀释至2 mg·mL-1，4 ℃下以10 000 r·min-1的转速离心20 min。提取上清液，过醋酸纤维膜（0.45 μm），25 ℃下采用粒度分布仪测定溶液内蛋白分子粒径的分布，取3次测量平均值进行绘图。

1.3.3 溶解度

将浓度为2 mg·mL-1的样品分散在磷酸盐缓冲液（pH7.0、10 mmol·L-1）中，在室温下搅拌，2 h后离心（12 000 r·min-1，4 ℃，20 min）。取上清液过0.45 ?m滤膜，利用BCA测定法测定上清液的蛋白含量。利用此方法测得的上清液蛋白质量与样品总蛋白质量的比值即为蛋白质的溶解度，计算公式如式（1）所示。

1.3.4 浊度

利用pH 7.0，10 mmol·L-1的磷酸缓冲液将样品稀释至蛋白浓度为2 mg·mL-1，经过2 h的溶解后，常采用分光光度计在500 nm测定蛋白质溶液的吸光度即为浊度。

1.3.5 体积排阻色谱

采用体积排阻色谱法分析蛋白质分子量分布情况。用Waters 2487高效液相泵和1525紫外检测器组成WATERS高效液相系统，而分析柱采用TSK G4000SW。洗脱液为100 mmol·L-1 pH为7.0的磷酸缓冲液（流速0.5 mL·min-1），采用滤膜（0.45 μm）抽滤后，超声脱气30 min。2 mg·mL-1的蛋白溶液经过滤、抽滤后上样，以恒定的流速洗脱，然后在220 nm下测定吸光值。洗脱时的流动速度为0.3 mL·min-1。标准蛋白有γ球蛋白（158 kDa）、肌红蛋白（16 951 Da）、卵清蛋白（44 287 Da）、牛血清白蛋白（66 kDa）与维生素B12（1 355.37 Da）。

2 结果与分析

2.1 热处理对大豆蛋白可溶性聚集体粒径的影响

如图1，提高热处理温度会使大豆蛋白粒径增大，形成大粒径尺寸（>1 000 nm）的蛋白热聚集體。由于热处理使大豆蛋白疏水基团暴露，分子间的疏水作用增强，导致粒径增大。温度达到100 ℃时，在10 nm处出现一个小粒径单体峰，并且相比较60 ℃和80 ℃加热处理的大粒径尺寸蛋白热聚集体的峰强呈减弱趋势，高温热处理导致大粒径聚集体热解聚形成了小分子粒径蛋白聚集体[2-3]。

2.2 热处理对大豆蛋白可溶性聚集体分子量分布的影响

图2为标准的蛋白分子量分布曲线图，由图3可知，热处理温度升高，蛋白聚集体的分子量分布峰（5～10 min）面积逐渐变大，表明大分子大豆蛋白可溶性热聚集体含量逐渐增加。而较高热处理下大豆球蛋白的分子量分布峰有所降低，表明大豆球蛋白的亚基参与了蛋白的可溶性热聚集[4-5]。

2.3 热处理对大豆蛋白可溶性聚集体浊度的影响

浊度是表征蛋白质溶液稳定性及聚集程度的关键指标[5]。浊度值能够侧面反映蛋白在溶液中的分散状态、粒径尺寸及溶解度大小[5]。如图4，大豆蛋白经热处理后，浊度明显变大（P<0.05），进一步表明随着热处理温度的升高，大豆蛋白聚集形成了可溶性蛋白聚集体。

3 结论

随着热处理温度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集体，粒径和分子量逐渐增大。浊度显著增加。60 ℃和80 ℃热诱导聚集体以单个分子颗粒状形式存在，而100 ℃热诱导聚集体呈小尺寸粒子形式。

参考文献：

[1]Castellania O，David B E.Effect of aggregation and sodium salt on emulsifying properties of egg yolk phosvitin[J]. Food Hydrocolloids，2005，19（4）：769-776.

[2]安 然.大豆分离蛋白可溶性热聚集行为及其超声调控研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2019.

[3]李向红，华欲飞，裘爱泳，等.体积排阻色谱和激光光散射对大豆蛋白热诱导聚集体的研究[J].中国油脂，2007，32（2）：74-77.

[4]郭凤仙.热处理对大豆分离蛋白结构及功能特性的影响[D].无锡：江南大学，2009.

[5]袁德保.大豆蛋白热聚集行为及其机理研究[D].广州：华南理工大学，2010.