美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP 可视化快速检测方法的建立与应用

（北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病，俗称“猪蓝耳病”。PRRS 1987 年首次暴发于美国，随后相继在加拿大以及欧洲和亚洲国家出现，目前已在世界范围内流行[1]。患病母猪通常表现早产、流产以及死胎数增加等不良临床症状，给养猪业带来巨大损失[2]。PRRSV 容易变异、毒株多样、感染时间长，因此防控难度较大[3-4]。1995 年我国首次发现PRRS。2006 年我国全面暴发了以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HPPRRSV）。

PRRSV 为单股正链RNA 病毒。根据病毒基因组及血清型特性，可将PRRSV 划分为两种基因型，即以LV 株为代表的基因1 型（欧洲型）和以VR2332 株为代表的基因2 型（美洲型）。我国主要流行基因2 型（美洲型）毒株。PRRS 的传播方式主要有接触传播、空气传播、精液传播以及垂直传播，病猪、带毒猪和患病母猪所产的仔猪，以及被污染的环境、用具等都是重要的传染源。各种品种、年龄和用途的猪均可被感染，但以妊娠母猪和1 月龄以内的仔猪最易感。40 日龄以内仔猪的PRRS 病死率可高达100%，育肥猪病死率约为50%；在一些地区的猪场，PRRS 的发病率可接近100%，病死率为30%～50%，有的可达80%以上[5]。PRRS 发病没有明显的季节性，各个季节均可发病，而且发病迅速，短期内便可波及全群或邻近群。因此，在临床上我国迫切需要一种能够快速诊断美洲型PRRSV 毒株的检测方法。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸体外等温扩增技术，利用链置换型DNA 聚合酶，在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60 min 内实现109～1010倍的扩增[6]，具有快速、特异、精确、简便等特点[7]。LAMP 反应能产生大量扩增产物，即焦磷酸镁白色沉淀，通过添加钙黄绿素（螯合剂）肉眼观察有无黄绿色荧光，即可判断靶基因是否存在。与常规PCR 相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，只需要一个简单的恒温装置，即可实现现场高通量快速检测，并且可与各种系统结合，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR 技术，而检测成本却远低于荧光定量PCR[8-10]。

本研究根据GenBank 中美洲型PRRSV 经典毒株JXA1 序列，通过在线生物设计软件设计合成LAMP 引物，同时在LAMP 技术的基础上添加了荧光，建立了美洲型PRRSV（NA-PRRSV）RTLAMP 可视化快速检测方法。该方法无需后续的电泳检测，可直接在仪器上检测荧光或者肉眼判定，因而提高了检测的灵敏度，为NA-PRRSV 的快速、准确鉴别提供了有效手段。

1 材料

1.1 菌（毒）株及相关试验材料

美洲型JXA1、VR2332、类NADC30 毒株，欧洲型LV 株以及猪健康细胞培养物，均由中国农业大学动物流行病学与人畜共患病重点实验室惠赠；猪瘟活疫苗C 株，购自广东永顺生物制药股份有限公司；猪伪狂犬病毒Bartha-K61 株，购自瑞普（保定）生物药业有限公司；猪圆环病毒2 型DNA 基因组，由本实验室保存。阳性质控标准品，为含有美洲型经典毒株基因组RNA 的提取液，阴性质控标准品为无RNA 酶蒸馏水，均由本实验室制备并保存。

1.2 主要试剂耗材和设备

核糖核酸扩增试剂盒（生产批号87001）、荧光目视检测试剂盒（生产批号94001）、loopamp®实时浊度测定仪器，均购自荣研生物科技（中国）有限公司；无RNA 酶蒸馏水（生产批号N10108），购自北京索莱宝科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒（生产批号20200101），购自杭州博日科技有限公司；PRRSV 实时荧光RT-PCR 检测试剂盒（生产批号HPRRS20180524P），购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；荧光定量PCR 仪ABI Quant Studio7，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TGuide S32 全自动核酸提取纯化仪，购自天根生化科技有限公司；移液器，购自德国Eppendorf公司。

2 方法

2.1 引物合成

根据GenBank 已发表的美洲型经典毒株JXA1序列（GenBank：EF112445.1），运用在线生物软件（http://primerexplorer.jp/），通过调整Tm 值、GC 含量、dG 临界值、扩增长度和片段区域等参数，设计适用于RT-LAMP 的特异性外引物和内引物。通过试验筛选出最佳外引物和内引物，并在此引物组基础上，设计最佳环引物，最终得到本研究的引物组合（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

2.2 核酸提取

按照磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书提供的操作方法，对美洲型 JXA1、VR2332、类NADC30 毒株，欧洲型毒株LV 株以及猪健康细胞培养物，猪瘟活疫苗C 株、猪圆环病毒2 型DNA基因组，猪伪狂犬病毒Bartha-K61株进行核酸提取，提取产物置-40 ℃冰箱保存。

2.3 反应体系建立及条件优化

2.3.1 反应体系建立 在loopamp®实时浊度测定仪器上，使用设计的引物组合进行LAMP 扩增。扩增反应体系为25 μL：RT-LAMP预混液18 μL（2×反应缓冲液12.5 μL、5 μmol/L 的外引物F3 1 μL、5 μmol/L 的外引物B3 1 μL、40 μmol/L 的内引物FIP 1 μL、40 μmol/L 的内引物BIP 1 μL、20 μmol/L的环引物LB 1 μL、无RNA 酶蒸馏水0.5 μL）、酶溶液1 μL、荧光目视检测试剂1 μL 和RNA 样品5 μL。同时设置阴、阳性对照。扩增反应工作程序为：65 ℃、45 min。检测结果判定：呈现绿色或有特定扩增曲线为阳性，呈现橘黄色或无特定扩增曲线为阴性。

2.3.2 反应温度优化 以美洲型JXA1、VR2332、类NADC30 毒株提取的核酸（10 ng/μL）为模板，利用建立的LAMP 反应体系，在loopamp®仪器上进行扩增，设置58、60、63、65 ℃等温度进行筛选。扩增反应工作程序为65 ℃、45 min。

2.4 引物特异性验证

选用美洲型 JXA1、VR2332、类NADC30 毒株以及欧洲型LV 毒株、猪瘟病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒和猪健康细胞培养物提取核酸，在loopamp®实时浊度测定仪器上，利用建立的LAMP反应体系，对设计的引物组合（表1）进行特异性验证。扩增反应工作程序为65 ℃、120 min。

2.5 灵敏度试验

将JXA1 毒株提取核酸，经数字PCR 定量为104copies/μL，进行10 倍倍比稀释后，分别进行RT-LAMP 和real-time PCR 扩增，检测灵敏度。

RT-LAMP总扩增反应体系为25 μL：RTLAMP 预混液18 μL、酶溶液1 μL、荧光目视检测试剂1 μL 和RNA 样品5 μL。扩增反应工作程序为65 ℃、45 min。

实时荧光RT-PCR 反应体系：按照PRRSV 实时荧光RT-PCR 检测试剂盒使用说明书进行操作。

2.6 特异性试验

用建立的LAMP 反应体系，分别以美洲型VR2332 株、JXA1 株、类NADC30 株，欧洲型LV株以及猪瘟病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒、猪健康细胞培养物等提取的核酸为模板进行试验，验证反应体系的特异性。

2.7 临床样品检测

将已知背景的30 份临床样品（22 份阴性、8份阳性）按要求处理后，分别进行RT-LAMP 和实时荧光RT-PCR 扩增，分析两种检测结果的符合率。

3 结果与分析

3.1 引物特异性验证

引物特异性扩增结果如图1 所示：美洲型JXA1（编号1）、VR2332（编号2）、类NADC30（编号3）毒株均在30 min 内检出，欧洲型LV 毒株、猪瘟病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒和猪健康细胞培养物（编号4～8）在120 min 内均未检出，表明筛选的引物组合具有较高的扩增效率和特异性。

图1 不同毒株在同种引物下的扩增效率

3.2 反应体系建立及条件优化

试验结果显示，以美洲型JXA1、VR2332、类NADC30 毒株提取的核酸为模板，当退火温度为65 ℃时，引物的扩增效率最高，因此确定65 ℃为最佳退火温度。最终反应体系为25 μL：RTLAMP 预混液18 μL、酶溶液1 μL、荧光目视检测试剂1 μL 和RNA 样品5 μL。扩增反应工作程序为65 ℃、45 min。

3.3 灵敏度试验

RT-LAMP 检测结果（图2）显示，管1～4 均为阳性（显示绿色），即该方法的检测最低限为10 copies/μL，与实时荧光RT-PCR 检测灵敏度（图3）基本一致。

图2 PRRSV 灵敏度试验检测结果

图3 PRRSV 实时荧光RT-PCR 检测结果

3.4 特异性试验

引物组合制备的试剂盒特异性检测结果（图4）显示：该检测方法可以成功检测出美洲型的VR2332 株、JXA1 株、类NADC30 株（分别对应管1～3），欧洲型LV 株、猪瘟病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒和猪健康细胞培养物均未检出（分别对应管4～8），表明本检测方法具有良好的特异性。

图4 试剂盒特异性检测结果

3.5 临床检测试验

将采集的30 份病料，提取核酸后分别进行RT-LAMP 方法与实时荧光RT-PCR 方法检测。结果（表2）显示，所建立的RT-LAMP 方法与荧光定量RT-PCR 方法检测结果一致，符合率为100%，但RT-LAMP 扩增时间（45 min）比实时荧光RT-PCR（80 min）短，说明建立的RT-LAMP检测方法特异性好、灵敏度高、方便快捷、结果准确可靠。

表2 RT-LAMP 与实时荧光RT-PCR 方法检测结果比对单位：份

4 讨论

PRRS 是一种猪的高度接触性传染病，1995 年在我国首次出现，1996 年首次在我国分离到病原，随后在我国迅速蔓延[11]。2006 年我国全面暴发了由HP-PRRSV 导致的PRRS 疫情。该毒株较之前国内流行的经典美洲型毒株出现了NSP2缺失[12]，对养猪业造成了巨大的冲击。PRRS 临床症状与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒感染相似，且常呈混合感染，导致确诊困难。

传统的PRRSV 检测方法主要包括病毒分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）和间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）等[13]。目前最常用的核酸检测方法有常规PCR 和荧光定量PCR 等。传统的PRRSV 检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 虽然较以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等优点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，难以在基层实际生产中普及应用。

2000 年环介导等温扩增技术（LAMP）由日本学者 Notomi 等[14]在《Nucleic Acids Res》杂志上公开介绍，随即受到了世界卫生组织（WHO）、各国学者和相关政府部门的关注。LAMP 技术作为一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，具有快速、特异、敏感、简便等优点，因而在核酸快速检测领域得到广泛应用。LAMP 方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分简单，在应用阶段对仪器的要求低，结果判读也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR 方法需要进行凝胶电泳观察结果，因而是一种适合现场、基层快速检测的方法。而且此方法的结果判断均不需要开盖检测，从而很好地避免了扩增产物污染，也适用于实验室相关研究[15]。

本研究针对美洲型PRRSV 经典毒株JXA1 序列，建立了荧光可视化的RT-LAMP 检测方法，证实可有效快速检测美洲型PRRSV。该方法灵敏性和特异性良好，最低检测限为10 copies/μL。同时RT-LAMP 检测方法扩增时间为45 min，与实时荧光RT-PCR 相比，在灵敏度相同的情况下能节省约35 min 的时间，且在任何一个恒温仪器上都可操作，十分便利。因此，本研究建立的RT-LAMP 可视化检测方法特异、灵敏、快速，适用于临床NAPRRSV 的快速检测，不仅可为猪场的病原筛查和疫情防控提供技术支撑，还能为了解病毒变异、预测疫情变化及采取有效防控措施提供参考。