牛结核病污染场4 种检测方法评估

2020-06-08张建东陈永林马宏伟刘天驹赵建东米吉提莫合他尔汗颜成旭路广计张喜悦

中国动物检疫 2020年6期

张建东，陈永林，马宏伟，刘天驹，张涛，李钊，赵建东，米吉提·莫合他尔汗，颜成旭，路广计，张喜悦

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.洛阳市动物疫病预防控制中心，河南洛阳 471000；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050000；4.石家庄市动物疫病预防控住中心，河北石家庄 050000；5.济源市动物疫病控制中心，河南济源 459000；6.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830000；7.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝杆菌属牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病，给我国养牛业带来严重危害[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛，除可感染人外，还可感染50 多种哺乳动物[2]。牛结核病目前尚无有效疫苗预防，药物治疗成本太高，所以“检测+扑杀”是控制该疫病的主要手段。

我国目前的牛结核病检测方法主要包括，结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、γ-干扰素ELISA试验（IFN-γ-ELISA）、抗体ELISA 试验和胶体金检测等[3]。TST 是我国牛结核病检测的国家标准，也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高，但特异性差，无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT 与TST相比，可排除其他杆菌干扰，减少假阳性。TST 和SICTT 检测成本低，但操作麻烦、耗时长，结果判定主观性强[4]。IFN-γ-ELISA 试验操作简单，但成本较高[5]。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法，但牛分枝杆菌抗原表位复杂，不同阶段可产生不同抗体，因而导致检测阳性率偏低[6]。

结核病污染场内，牛分枝杆菌普遍存在，需要敏感性更高的检测方法，来尽量避免漏检，从而加快净化进程。本试验采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗体ELISA 4 种检测方法，同时对牛结核病污染场的牛群进行检测，比较分析不同试验的检测结果，以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器牛PPD、禽PPD、INF-γ 夹心ELISA 检测试剂盒（批次P201906-001），均购自青岛瑞尔公司；牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒（批号190504），购自韩国安世佳合有限责任公司。仪器包括：剪毛剪、0.5 mL 注射器、游标卡尺、酶标仪（包含450 nm 和620～650 nm 滤光片）、CO2培养箱、12 孔细胞培养板、肝素钠采血管、移液器及吸头等。

1.1.2 试验动物某规模养殖场的300头泌乳牛。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

1.2.1.1 TST 试验按照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/T 18645—2002）的要求操作和结果判定：采用牛型PPD，剂量为2 000 IU，分别于注射前和注射后72 h 测量皮肤厚度，并计算皮厚差。皮厚差≥4.0 mm，为阳性；2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm，为疑似；皮厚差＜2.0 mm，为阴性。疑似牛于第1 次检疫 60 d 后进行复检，仍为疑似时，60 d 后再复检，如仍为疑似，则判为阳性。

1.2.1.2 SICTT 试验采用牛PPD 和禽PPD，在牛颈部左侧分点皮内注射，注射点间隔12～15 cm，72 h 后，观察注射部位的炎性反应，并量取皮皱厚，根据皮皱厚增加值判定。牛型PPD 皮厚差减去禽型PPD 皮厚差＞4 mm，判为阳性；1 mm ＜牛型PPD 皮厚差减去禽型PPD 皮厚差≤4 mm，判为可疑；牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD 皮厚差，判为阴性。

1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 试验采集5 mL 血液肝素抗凝血液，各取1.5 mL 加入3 个孔中，然后分别取100 μL 的牛型PPD、禽型PPD 和阴性对照磷酸盐缓冲液（PBS），加入抗凝全血中，混匀后放于含5% CO2的培养箱中37 ℃培养18 h。用移液器小心吸取培养上清，转入1.5 mL 离心管中，即获得刺激产生的γ-干扰素上清。取出单抗包被板，每孔加入50 μL 样品稀释液，然后加入50 μL 待测样品或对照，混匀后室温作用1 h；洗涤，每孔加入100 μL 酶标抗体，室温作用1 h；洗涤后每孔加入100 μL 底物，室温避光作用30 min 后，加入终止液，测定OD450nm值。当牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清OD 值-禽型PPD 刺激上清OD值≥0.1，为阳性，反之为阴性。

1.2.1.4 抗体ELISA 试验按照牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒操作步骤进行，计算S/P值。S/P=（样品OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）/（阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）。S/P≥0.3 为阳性，S/P＜0.3为阴性。

1.2.2 评估方法以TST 试验为参考标准，分别与SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体ELISA 检测结果比较，计算符合率，并运用SPSS 软件进行对比，分析敏感性差异。

2 结果与分析

2.1 TST 与IFN-γ-ELISA

对比结果（表1）显示：TST 检出阳性114 份，IFN-γ-ELISA 检出阳性154 份，符合率为72.7%，经SPSS 分析，P＜0.05，说明IFN-γ-ELISA 阳性检出率显著高于TST，表明其敏感性明显高于TST。

表1 TST 与IFN-γ-ELISA 检测结果对比单位：份

2.2 TST 与SICTT

对比结果（表2）显示：TST 检出阳性114份，SICTT 检出阳性103 份，符合率为96.3%，经SPSS 分析，P＞0.05，说明SICTT 阳性检出率略低于TST，但差异不显著，表明两种方法的敏感性相似。

表2 TST 与SICTT 检测结果对比单位：份

2.3 TST 与抗体ELISA

对比结果（表3）显示：TST 检出阳性114 份，抗体ELISA 检出阳性21 份，符合率为69.0%，经SPSS 分析，P＜0.05，说明抗体ELISA 阳性检出率显著低于TST，表明其敏感性明显低于TST。

表3 TST 与抗体ELISA 检测结果对比单位：份

3 讨论

近年来，我国牛结核病流行率普遍升高，结核病污染场数量逐渐增加[7]。本试验利用4 种检测方法，对结核病污染场的奶牛进行检测。以TST为参考标准，分别与其他3 种方法进行比较，结果发现IFN-γ-ELISA 敏感性最高，明显大于TST，而其他2 种方法的敏感性都低于TST。在牛结核病污染场的净化过程中，要将所有感染牛尽可能全部筛检出来，这就需要敏感性高的检测方法，因此IFN-γ-ELISA 是首选的检测方法。

TST 试验是国家标准，也是国际贸易指定方法，但其结果判定存在人为误差，尤其是大量检测时，会出现阳性漏检。在牛结核病污染场的净化初期，需要进行大量检测，如果采用TST 检测，就会漏检感染牛，使其继续污染牛群[8-9]。SICTT 虽然可排除禽结核杆菌的干扰，检测结果准确，但其阳性检出率更低，同样不适合牛结核病污染场初期的净化。抗体ELISA 检测是现代血清检测的主要方法，操作简单、耗时少，但因不同感染阶段的牛分支杆菌抗体比较复杂，无法准确捕获[10]，导致阳性检出率也明显比TST 偏低，因此也不适合用于牛结核病污染场初期的净化检测。

TST 和SICTT 这两种方法适合在基层推广，成本低，但主观性强，检测过程对牛的应激影响较大[11]。抗体ELISA 检测时间短，出结果快，但成本较高，阳性检出率偏低[12]。IFN-γ-ELISA 操作复杂、成本高，检测要求较高，不适合在基层推广，但检测敏感性高[13]。因此，在实际的牛结核病检测中，应根据不同的需要和条件，选择合适的检测方法，也可以不同方法联合使用。在条件不允许情况下，可以用TST 对牛结核病污染场进行检测。因IFN-γ-ELISA 是4 个方法中最敏感的方法[14]，所以在条件允许的情况下，在牛结核病污染场最适合选用，这样可以尽量避免漏检感染牛。在牛结核病污染场，患结核病的牛数量较多，如果检测方法不敏感，就会导致大量阳性牛漏检，使牛群净化困难[15]。如果每年春秋两季，对牛场进行IFN-γ-ELISA 检测，及时隔离淘汰阳性牛，连续检测几年，牛场就会达到净化目标[16]。