基于移液器吸头的微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备及其性能

马恩慧，文 学，戴莹菲，周 洁，吴长宇

（徐州医科大学医学影像学院，江苏徐州 221004）

1 引言

参比电极（RE）是一种具有已知恒定电位的电极，能够为电化学研究对象提供一个电位标准[1-2]，常用的商业化参比电极有饱和甘汞电极（SCE）、Ag/AgCl电极等。这些电极通常由导线、电极帽、电极丝、玻璃管、电极液、多孔陶瓷等组成，因而体积也比较大，比如常用的饱和甘汞电极的长度通常大于10cm，末端的直径也在1cm左右。将其用于构成三电极体系进行电化学测量时，需要较多的电解液体积（通常需要数毫升），因此不适用于血液、脑脊液等小体积生物样本的分析。同时传统参比电极需要参比内液，这必然会造成漏液等问题，一方面会污染样品，另一方面在其使用过程中需要定期更换内液[3-5]。

为减小参比电极的尺寸，解决传统参比电极漏液的问题，本研究设计并制备了基于移液器吸头的微型全固态Ag/AgCl参比电极（ASSmRE），以KCl饱和的琼脂凝胶代替传统的参比内液[6-7]，优化了AgCl的成膜时间，探索了琼脂凝胶填充方法。同时通过比较，发现制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极和饱和甘汞电极具有相近的性能，可以用于电化学测试。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

氯化钾、亚铁氰化钾、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂（AR）购自国药集团化学试剂有限公司，银丝（99.999%）购自国药集团化学试剂有限公司，琼脂粉（BR）购自大连美仑生物技术有限公司。

电化学工作站（CHI 760D，上海辰华仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；金盘电极（Φ 2mm，天津艾达恒晟科技发展有限公司）；铂对电极（上海辰华仪器有限公司）；饱和甘汞电极（上海辰华仪器有限公司）；移液器吸头（白色，10µL，范德（北京）生物科技有限责任公司）。

2.2 微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备

微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备过程如图1所示，包括银丝的处理、KCl饱和琼脂溶胶的配制、KCl饱和琼脂凝胶的填充、微型全固态参比电极的封装等步骤。

图1 微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备过程示意图

2.2.1 银丝的处理

取约15cm长银丝，将其一端没入装有84消毒液（次氯酸溶液）的玻璃瓶中浸泡。待银丝表面变成灰白色后取出，用去离子水冲洗干净并晾干。将银丝的灰色部分置入小号的移液器吸头（10µL）内，露出的部分缠绕在白色吸头上端，并用胶带固定防止银丝脱落。

2.2.2 KCl饱和琼脂溶胶的配制

将10mL去离子水加入到烧杯中，置于电炉上加热，逐渐加入KCl固体，使用玻璃棒搅拌，使溶质逐渐溶解，直至溶液中有些许KCl溶质不再溶解后停止加入。用电子天平称取0.36g琼脂粉，加入到沸腾的KCl溶液中，用玻璃棒搅拌并继续加热保持沸腾，形成KCl饱和琼脂溶胶。

2.2.3 KCl饱和琼脂凝胶的填充

使用注射器（去掉针头）吸取沸腾的KCl饱和琼脂溶胶，迅速注入置有银丝的白色吸头中，可以多次注入琼脂溶胶，以压实白色吸头内的琼脂，待冷却后即完成吸头内KCl饱和琼脂凝胶的填充，用作微型全固态参比电极的导电介质。

2.2.4 微型全固态参比电极的封装

另取一个白色吸头，用刀截去其底部。将截去底部的吸头倒置，和KCl饱和琼脂凝胶填充后的白色吸头以“上端对上端”的形式相对接，并将银丝从截去底部的吸头中抽出；将704硅橡胶挤入截去底部的吸头内，等待硅胶硬化；将热缩管套在两个白色吸头的对接处，用热风枪加热使其逐渐缩紧，以使得两个白色吸头牢靠地连在一起；将抽出的银丝缠绕在铜线的一端，并用电烙铁焊接起来；最后取直径合适的热缩管套在焊锡处，加热使其缩紧，基于移液器吸头的微型全固态Ag/AgCl参比电极制作完成。

2.3 微型全固态Ag/AgCl参比电极的性能测试

2.3.1 参比电极的稳定性测试及参考电位的确定

本实验使用CHI 760D电化学工作站，借助循环伏安法（CV），通过与商业化的饱和甘汞电极进行对比，测试了该微型全固态Ag/AgCl参比电极的性能。以金电极为工作电极，铂电极为对电极，分别以饱和甘汞电极以及制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极为参比电极，测得铁氰化钾溶液的循环伏安谱图，比较其峰电流、峰电位、表观电位等参数，同时来确定微型全固态Ag/AgCl参比电极的参比电位。将循环伏安谱的扫描圈数设置成10圈，测试连续扫描时的峰电位和峰电流的变化趋势，以验证该微型全固态Ag/AgCl参比电极的稳定性。

以微型全固态Ag/AgCl参比电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成回路来测量开路电压（OCP），即微型全固态Ag/AgCl参比电极和饱和甘汞电极之间的参考电位差。将制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极放置30d，并测试其开路电压，确定其长期稳定性。

2.3.2 不同扫描速度时铁氰化钾溶液的电化学响应

以金电极为工作电极，铂电极为对电极，分别以饱和甘汞电极以及制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极为参比电极，分别测定扫描速度为10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250mV/s时铁氰化钾溶液（1mM）的循环伏安谱，并比较二者的差异。

2.3.3 不同浓度铁氰化钾溶液的电化学响应

以饱和甘汞电极为参比电极，在扫描速度保持不变的条件下，改变铁氰化钾溶液浓度（1.000、0.889、0.800、0.727、0.667、0.671、0.533、0.500mM），依次进行扫描获得循环伏安谱。将饱和甘汞电极换成制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极，同样获得上述不同浓度铁氰化钾溶液的循环伏安谱。

3 结果与讨论

3.1 微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备

在微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备过程中，使用84消毒液浸泡银丝的一端，浸泡一段时间后银丝表面会呈现灰白色。84消毒液的主要成分为次氯酸钠（NaClO），水解后生成不稳定的次氯酸，进而分解为氯化氢等物质。因此银丝表面可能发生的化学反应是：

而当银丝浸泡时间过长时会逐渐变成黑色，可能原因有两个：银丝氧化为氧化银而显黑色；AgCl见光分解生成的Ag颗粒显黑色。因此浸泡时间选为5min。

在给置入银丝后的吸头中注入热的KCl饱和琼脂溶胶时，冷却为固态的凝胶，但其内部以及和吸头管壁间容易产生气泡或者间隙，导致实验过程中离子交换不能顺利进行，从而导致所制作的微型全固态Ag/AgCl参比电极出现参考电位稳定性不强的问题。优化方法是在注入加热的KCl饱和的琼脂溶胶时，将洗头的尖端堵住，然后用注射器将KCl饱和琼脂溶胶缓慢地注入并压实，以保证琼脂溶胶在枪头中压实并无气泡空隙产生。

制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极如图2所示。在使用时将吸头的尖端没入电解质溶液作为参比电极，注意液面不要没过热缩管，防止溶液爬升，腐蚀银丝及铜导线，进而污染电极。此外，和其他参比电极类似，需要将微型全固态Ag/AgCl参比电极浸泡在饱和KCl溶液中储存备用，防止干涸产生气泡。

图2 微型全固态Ag/AgCl参比电极实物图

3.2 微型全固态Ag/AgCl参比电极的性能测试

参比电极通常需要具有稳定的电势，才能保证电化学测量的准确性。在完成微型全固态Ag/AgCl参比电极的制备后，通过与商业化的饱和甘汞电极对比，使用循环伏安法研究了该电极的性能。

3.2.1 微型全固态Ag/AgCl参比电极的参比电位

通过与商业化的饱和甘汞电极进行比对，确定了微型全固态Ag/AgCl参比电极的参比电位[8]。从图3和表1中可以看出，两个电极作为参比电极所测出的循环伏安谱图，峰电流大小几乎没有变化，但峰电位有明显的不同。当饱和甘汞电极作为参比电极时，铁氰化钾溶液的循环伏安谱图具有一定的对称性，表现出可逆的氧化还原特性，其中峰电位差ΔEp为0.151V，表观电位Eo为0.162V。当用微型全固态Ag/AgCl参比电极作为参比电极时，铁氰化钾的循环伏安谱图同样具有一定的对称性，ΔEp为0.126V，Eo为0.210V。相对于饱和甘汞电极，微型全固态Ag/AgCl参比电极作为参比电极时铁氰化钾的氧化还原峰电位向正电位方向移动。微型全固态Ag/AgCl参比电极（ASSmRE）和饱和甘汞电极（SCE）之间的参比电位差可以通过铁氰化钾的表观电位计算得到：

表1 不同参比电极时，铁氰化钾循环伏安谱图的峰电位参数的对比

图3 不同参比电极时，铁氰化钾溶液（0.8mM）的循环伏安谱图

参比电极为饱和甘汞电极和微型全固态Ag/AgCl参比电极，扫描速度为50mV/s。

3.2.2 连续扫描时的稳定性测试

将制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极作为参比电极，在铁氰化钾中进行了连续10圈的循环伏安谱扫描，采集了每次扫描的峰电位和峰电流。如图4所示，连续扫描中每次扫描的氧化还原反应的峰电流和峰电位基本保持不变，其中峰电位的大小波动约2mV（0.92%）。因此，微型全固态Ag/AgCl参比电极在连续扫描时具有较好的稳定性，可以用作参比电极。

金盘电极为工作电极，铂电极为对电极，制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极为参比电极，扫描速度为50mV/s。

3.2.3 长期稳定性测试

制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极需要放置在饱和KCl溶液中，以保持其稳定性。本文还研究了微型全固态Ag/AgCl参比电极的长期稳定性。以制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极测定其在饱和KCl溶液中的开路电压[8]。结果如图5所示，微型全固态Ag/AgCl电极电位在100s左右达到稳定，与饱和甘汞电极相差48.09mV，与循环伏安法的结果一致。图5中插图为30d内参比电位的变化趋势图，结果显示微型全固态Ag/AgCl电极电位在30d内波动为0.28mV（0.33%），表明该参比电极稳定性良好，可以用于后续的实验。

3.2.4 不同扫描速度时铁氰化钾溶液的电化学响应

进一步研究了在不同扫描速度下、以微型全固态Ag/AgCl参比电极为参比电极时铁氰化钾溶液的循环伏安谱，结果如图6A所示。结果表明，铁氰化钾溶液的循环伏安谱中峰电流均随着扫描速度的增大而增大。以扫描速度为横坐标，以峰电流为纵坐标作图（图6B），可以看出峰电流和扫描速度满足着一定的线性关系。同时以扫描速度的平方根为横坐标，以峰电流为纵坐标作图（图6C），结果显示峰电流与扫描速度的平方根有着很好的线性关系，其拟合方程是ip，1=0.253+41.732×υ1/2（R2=0.997 7） 和ip，2=-2.545-20.149×υ1/2（R2=0.992 4）。 这 表明铁氰化钾在电极上的电化学行为是受扩散控制的[9-10]，这和以饱和甘汞电极为参比电极的结果是一致的。这些结果也进一步地证明了微型全固态Ag/AgCl参比电极具有较好的性能。

图4 在铁氰化钾（1mM）中连续扫描10圈时的循环伏安谱（A）以及峰电流（B）和峰电位（C）的变化趋势图

图5 在饱和KCl溶液中的开路电压-时间曲线图

图6 不同扫描速度情况下，铁氰化钾（1mM）溶液的循环伏安谱

金盘电极为工作电极，铂电极为对电极，制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极为参比电极。

3.2.5 不同浓度铁氰化钾溶液的电化学响应

本论文还研究了微型全固态Ag/AgCl参比电极作为参比电极时不同浓度铁氰化钾的电化学响应。如图7A所示，随着铁氰化钾浓度的增加，循环伏安谱的峰电流也逐渐增加。如图7B所示，峰电流和铁氰化钾浓度呈现着线性关系，即ip,1=0.959+9.076×c（R2=0.993 3） 和ip,2=-0.696-7.570×c（R2=0.983 9）。这些结果与以饱和甘汞电极为参比电极的结果是一致的，也说明微型全固态Ag/AgCl参比电极的性能较好，可以用于电化学实验。

图7 在微型全固态Ag/AgCl参比电极分别作为参比电极时，不同浓度铁氰化钾溶液的循环伏安谱（A）及峰电流与浓度的关系曲线（B）

金盘电极为工作电极，铂电极为对电极，制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极，扫描速度为50mV/s。

4 结论

设计并制备了基于移液器吸头的微型全固态Ag/AgCl参比电极，具有制作方便、价格低廉等特点，解决了传统参比电极尺寸较大、存在漏液等问题。通过比较发现，制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极和饱和甘汞电极具有相近的性能，具有较好的短期稳定性和长期稳定性，铁氰化钾溶液在该参比电极组成的电化学体系中具有良好的电化学响应。因此制备的微型全固态Ag/AgCl参比电极可以用于电化学测试。