应用补体活化体外模型评价姜黄素脂质体

修 宪，冯彩霞，相会欣，孟 阳，王 丽

0 引言

姜黄素(Curcumin)属于天然酚类色素，是从姜黄、莪术、郁金根茎中分离出的活性物质之一[1]。研究表明，姜黄素在抗氧化、抗炎(神经变性疾病、糖尿病、过敏、哮喘、支气管炎、肠炎、风湿病和牛皮癣)[2]、抗动脉粥样硬化[3-4]、抗肿瘤[5-7]方面均表现出很好的药理作用。姜黄素也具有抗增生、抗人类免疫缺陷、抗病毒、免疫调节、保护肝脏和肾脏等功效。姜黄素易溶于甲醇、乙醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，微溶于苯和乙醚，不溶于水。由于姜黄素水溶性差，不能用于静脉注射给药，为解决这一问题，本课题组将姜黄素制备成可用于注射给药的脂质体制剂。

已经上市销售的一些脂质体制剂和小分子胶束制剂，例如盐酸多柔比星脂质体、两性霉素B脂质体、紫杉醇注射液及多西他赛注射液，能够通过引起补体激活导致过敏反应发生，这种反应称为补体激活相关的假性过敏反应(Complement activation-related pseudo-allergic reactions，CARPA)。美国药品监管部门建议在药物毒性检测中增加体内或体外补体活性检测，来预测药物制剂发生假性过敏反应的风险[8]。

为了预测姜黄素脂质体是否会发生CARPA，比较不同批次(制备工艺相同，批量不同)姜黄素脂质体免疫毒性的区别。我们建立了补体活化体外模型，并对姜黄素脂质体进行了初步评价。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣)；离心机(H1750，湖南湘仪)；涡旋混合器(Vortex3，IKA)；真空干燥箱(YZF-6050，上海姚氏仪器厂)；均质机(LV1，Microfluidics)，多功能酶标仪(Varioskan Flash，Thermo)。姜黄素(石药集团，批号：150701A)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，Lipoid公司，批号：L12113C)；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG，Lipoid公司，批号：L13105G)；人免疫球蛋白IgG(Sigma公司，批号：SLBR0560V)；酵母多糖Zymosan A(Sigma公司，批号：BCBK3273K)；人补体SC5b-9因子ELISA试剂盒(Quide公司，批号:077713)；补体活性评价试剂盒Complement system Screen(EURO Diagnostica公司，批号：SS3434)。

2 方法与结果

2.1 姜黄素脂质体制备 称取姜黄素、DMPC、DMPG于圆底烧瓶中，量取甲醇、氯仿混合溶剂(1∶1)，避光搅拌或超声使姜黄素完全溶解，形成近橙黄色透明溶液，采用旋转蒸发仪40 ℃减压加热除去有机溶剂，形成透明的橙黄色薄膜，避光30 ℃，30 mmHg真空干燥箱内放置24 h。加入5%葡萄糖注射液50 ℃避光水化1 h，采用均质机7 000 psi均质至粒径约为(115±10)nm，采用0.45 μm针头滤器过滤后，再于无菌环境中采用0.22 μm无菌滤膜过滤，4 ℃保存备用。

2.2 补体活化体外模型

2.2.1 标准反应血清 本研究使用人血清进行试验，为了避免血清样本量小导致的不同批次检测结果难以比较的问题，血清采集自39例健康志愿者，血清采集前使志愿者充分了解血清采集目的，并签署知情同意书，采集过程符合伦理要求。采集志愿者全血收集于真空玻璃促凝管内，室温放置0.5 h使其凝固，将促凝管置于离心机内3 000 r/min离心5 min，收集上层血清，取每位志愿者血清200 μl置于离心管内充分混匀后分装作为标准反应血清，将分装后的标准反应血清及剩余志愿者血清放置在-80 ℃条件下保存。

2.2.2 标准阳性对照血清 取-80 ℃条件下保存的标准反应血清，置37 ℃水浴中融化后置于冰上，加入人IgG(终浓度为1 mg/ml)和zymosan A(终浓度为10 mg/ml)，激活标准反应血清中的补体成分后得到标准阳性对照血清[9]，用于不同批次检测的相对定量。标准阳性对照血清制备完成后，分装，放置在-80 ℃条件下保存。

2.2.3 姜黄素脂质体作用下的体外补体激活 取-80 ℃条件下保存的标准反应血清，置37 ℃水浴中融化后置于冰上，取融化的标准反应血清，加入10 μl姜黄素脂质体，置水浴振荡中37 ℃孵育0.5 h，加入EDTA终止反应完成体外补体激活，其中EDTA终浓度应为20 mmol/L，完成补体激活的血清样品置于冰上待检。

2.2.4 补体活性检测 使用ELISA试剂盒检测激活后的血清样品中的SC5b-9浓度。按照试剂盒说明书的建议对待测样品进行稀释后，加入到ELISA试剂盒对应的孔中，按照试剂盒说明书完成后续操作，在450 nm波长处检测吸光度数值并计算补体浓度。

对标准反应血清补体活性进行检测[10]，通过检测不同途径中共同产物SC5b-9，来评价标准反应血清3条途径的补体活性，结果经典途径、替代途径和甘露聚糖结合凝集素途径补体活性分别为76.4%、91.0%、97.8%。另外通过实验表明，标准反应血清经过3次冻融后，SC5b-9含量变化不明显；加入人IgG和zymosan A激活后，3次冻融的血清中SC5b-9含量均增加但差异无统计学意义。这说明本研究制备的标准反应血清在3次冻融后没有失活或自发激活，用于补体体外活化是合适的，血清反复冻融次数≤3次对实验结果无影响。

2.3 姜黄素脂质体激活补体能力的检测 按照“2.2”项下方法检测170301、170302、170303批次姜黄素脂质体激活补体能力，将姜黄素脂质体加入到标准反应血清中，阳性对照组(Positive control，PC组)为上述经过人IgG和zymosan A激活的标准阳性对照血清，阴性对照组(Negative control，NC组)为用5%葡萄糖溶液稀释后的标准反应血清，通过检测SC5b-9含量判断姜黄素脂质体能否激活补体以及不同批次姜黄素脂质体激活补体能力的差别。SC5b-9含量结果用SPSS 19.0处理，采用t检验进行显著性分析，见图1。

图1 经姜黄素脂质体激活后血清中SC5b-9含量

3 讨论

应用补体活化体外模型对姜黄素脂质体激活补体能力进行评价，能够快捷地检测出药物体外激活补体后血清中SC5b-9含量，结果与NC组比较，SC5b-9含量明显升高；试验中3个批次姜黄素脂质体制备工艺相同，批量不同，3个批次药物激活补体后SC5b-9含量几乎无差别，说明课题组选取的制备工艺制备出不同批量(一定批量范围内)批次的姜黄素脂质体激活补体的能力相同；由于脂质体制剂制备工艺较为复杂，生产批量可能会对制剂相关性质产生影响，本研究结果能够在批量放大方面提供一定理论支持；通过使用标准阳性对照，可以比较不同检测之间的结果，这为比较小试产品、中试产品以及相同批量不同批次产品免疫学毒性提供了一种方法。

本研究选用人血清而未选用相对容易获得的动物血清进行试验。由于人与动物补体系统存在差异，人血清与动物血清实验结果可能存在不一致，使用动物血清参考价值有限；采用人血清进行实验，存在血清获取难、不同检测批次结果无法比较的问题。为解决上述问题，实验用标准反应血清为多人的血清混合后而得，使得有足够量的血清用于补体激活实验，同时避免了个体差异的影响；实验证实，经过冻融的标准反应血清不会对补体激活造成影响，也就是说每次实验使用相同的标准反应血清，并制备标准阳性对照，这样不同批次检测结果也可以相互比较。

研究表明，药物制剂激活血清中补体后，药物组SC5b-9浓度较空白组增加超过300%时，发生过敏反应的风险较高[11]。参照上述标准，姜黄素脂质体组SC5b-9浓度与NC组相比，增加了约330%，说明本课题组制备的姜黄素脂质体应用于临床时发生CARPA反应的可能性较大，具体结果请关注课题组的后续研究。