养胃颗粒中NF-κB靶标介导的治疗胃溃疡成分的筛选与评价研究

2020-06-08吕玉玲谭梅英廖银标

实用药物与临床 2020年3期

吕玉玲，谭梅英，廖银标*

0 引言

胃溃疡常采用口服药物治疗。其中，主要为H2受体拮抗剂或质子泵抑制剂等，益生菌等调节菌群平衡的药物可用于恢复胃部微生物平衡[1-3]。现代药理学研究表明，发生肠胃等消化系统器官疾病时，部分与炎症及能量代谢相关的靶标可能发生异常表达，进而调控胃黏膜细胞的再生、修复和凋亡，导致疾病的发生。中医辨证则认为，胃溃疡系外邪入侵，脾胃虚寒等因素导致，可采用扶正驱邪、温阳解郁等方法，恢复相关脏器的机能与平衡[4-7]。因此，中药治疗脾胃疾病，主要采用黄芪、白术、三七、太子参等补气活血、驱邪除寒功效的药材进行组方。

养胃颗粒由黄芪、三七、白术、太子参等多味药材煎煮所得浸膏经制粒所得，主要起养胃正气、扶阳驱邪之功效[8-9]。其中，黄芪为君药，起养胃保肝、补气活血的作用，能够有效地保护胃黏膜，同时，可以通过激活FXR、Cdx2等相关靶标，调控胆汁酸的外排，减轻胃肠道炎症反应[10-11]；三七、太子参为臣药，所含活性成分多为皂苷类，可以与黄芪中的活性成分起协同治疗作用。目前，虽然方中多种药味已有质量标准研究的相关报道，但上述成分的量效关系如何，在配伍、组方之后，其作用机制是否出现变化，以及其中哪些成分起主要作用，尚未见报道。

本研究基于复方药物中的化学成分的靶标激动活性，评价上述成分在相关疾病治疗中的作用及其程度。通过一系列分子生物学、药物分析学和天然药物化学实验，对已有文献报道的养胃颗粒各药味中的化学成分，如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、白术内酯I、车叶草苷等进行靶标亲和活性评价，研究其对NF-κB靶标的影响，进而评价该制剂在胃溃疡、慢性萎缩性胃病和胃黏膜损伤等疾病治疗方面的作用。NF-κB广泛分布于生物机体的各个脏器中，具有调节炎症反应等功能，其激动剂与拮抗剂可能是中药治疗胃溃疡的主要成分[12-16]。因此，通过筛选养胃颗粒中已知化学成分进行NF-κB亲和活性筛选，并测定这些成分在成方制剂中的含量，可以为其后续开发及机制研究提供宝贵经验[17-20]。

1 仪器与材料

Thermo-TSQ高效液相色谱-质谱联用仪(Thermo-Fisher，美国)，配备Accela高压泵和ESI离子源；Life Qubit蛋白荧光定量仪(Qubit，美国)；试剂盒；LC-MS分析、样品处理、细胞实验所用甲酸、乙腈购自Merck(德国)、甲醇、DMSO购自Thermo-Fisher(美国)；黄芪甲苷(批号：110316-200905)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：070903-070324)、三七皂苷R1(批号：081305-201003)、人参皂苷Rb1(批号：110302-20120513)、人参皂苷Rb3(批号：050712-200908)购自中国食品药品检定研究院；白术内酯I(批号：R-004-1305)、车叶草苷(批号：R-0301-100)购自成都瑞芬思生物科技有限公司(中国)；养胃颗粒由笔者所在单位制备，批号：20170201-20180503。

2 方法与结果

2.1 NF-κB激动活性筛选取RAW264.7细胞株，置于96孔板上，加NF-κB质粒转染，孵育，将所得细胞进行荧光标记，分为空白组、阳性对照组和给药组。除空白组外，各组加入0.5 μg/ml的LPS。给药组分别给予毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、白术内酯I、车叶草苷对照品溶液(12.5、25、50 μmol/L DMSO溶液)，每个化合物的每个浓度给予3孔，孵育。所得样品进行荧光测定，根据结果判断各成分的NF-κB靶标激动活性。按以下公式计算各化合物对NF-κB转录活性的抑制率：抑制率%=[1-(CS-A0)/(Cm-C0)]×100。Cm为模型组荧光值，即LPS诱导的NF-κB转录因子活性上调水平；C0为空白对照组荧光值，即NF-κB 转录因子活性的基础水平；Cs为LPS 与受试药物共刺激细胞时的荧光值，即受试药物对NF-κB 转录因子活性的抑制水平。所得结果代入Graph Prism5.0软件分析，结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的NF-κB靶标激动活性较强，可以作为后续基于功效主治的指标成分。见表1、图1。

表1 养胃颗粒各成分NF-κB 转录因子活性的抑制率测定结果(n=3)

图1 各成分NF-κB 转录因子活性的抑制率测定结果

2.2 含量测定供试品的制备取养胃颗粒约0.5 g，精密称定，加甲醇50 ml，精密称定重量，超声30 min，取出，放冷后以甲醇补足重量；精密吸取所得溶液100 μl，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 含量测定对照品溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1对照品适量，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；精密吸取所得溶液100 μl，置于另一10 ml量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得2种对照品含量均为1 μg/ml的对照品溶液。

2.4 LC-MS条件采用ESI离子源，正负离子同时扫描模式，喷雾电压3 500 V，雾化温度350 ℃，鞘气压力30 psi，辅气压力10 psi；离子对为毛蕊异黄酮葡萄糖苷786/425(正离子，碰撞电压23 V)，三七皂苷R1为945/925(负离子，碰撞电压17 V)。液相色谱部分，色谱柱为Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，使用0.1%甲酸(A)-乙腈(B)作为流动相，梯度洗脱，程序为：0～0.2 min，10% B，0.2～0.7 min，10%～90%B，0.7～1.7 min，90%B，1.7～2.0 min，90%～10%B。测定所得对照品和供试品离子图见图2。

图2 养胃颗粒供试品(A)和对照品(B)(A、B浓度均为0.1 μg/ml)溶液离子流图

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线和线性精密吸取对照品溶液适量，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，分别配制不同浓度的6份样品，浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/ml。吸取上述溶液，分别按“2.4”项下LC-MS条件进行测定，记录总离子流图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面积。以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，代入Excel中进行线性回归，得回归方程为Y=1 669 715.206 6 X-6 671.214 0(毛蕊异黄酮葡萄糖苷，r2=0.999 3)和Y=661 286 X+151.87(三七皂苷R1，r2=0.999 1)，表明方法线性良好，能够在0.01～1.00 μg/ml浓度范围内对毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1进行准确测定。

2.5.2 精密度试验取供试品溶液，按“2.4”项下LC-MS条件进行测定，记录总离子流图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面积，计算RSD。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为2.23%，三七皂苷R1峰面积的RSD为0.47%，表明方法精密度良好。

2.5.3 回收率试验取养胃颗粒约0.25 g，精密称定，置50 ml锥形瓶中，共称定3份；每份样品按表2、表3所述最终浓度加入适量对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下LC-MS条件进行测定，每份样品平行测定3次。记录总离子流图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面积，计算二者含量、回收率和RSD。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为100.86%，RSD为3.02%；三七皂苷R1的平均回收率为99.92%，RSD为2.82%。表明方法准确度良好。

2.5.4 稳定性试验取供试品溶液，置于自动进样器中，分别在0、2、4、6、12、24 h按“2.4” 项下LC-MS条件进行测定，记录总离子流图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面积，计算二者含量和RSD。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的RSD为1.77%，三七皂苷R1的RSD为0.88%，表明方法所制备样品在24 h内稳定性良好。

2.6 样品测定取养胃颗粒10批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4” 项下LC-MS条件进行测定，记录总离子流图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面积，计算二者含量和RSD。结果显示，10批养胃颗粒中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均含量为0.834 mg/g，RSD为19.42%；三七皂苷R1的平均含量为0.512 mg/g，RSD为36.37%。见表4。

3 讨论

养胃颗粒以黄芪为君药，刘小花等[9]的研究表明，黄芪对胃溃疡和胃黏膜损伤具有较好的治疗作用，谱效学研究结果证实，黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有较高的贡献度。因此，结合“2.1”项下机理研究结果，可以将毛蕊异黄酮葡萄糖苷列为养胃颗粒治疗胃溃疡的活性成分之一。有报道，三七联合黄芪使用时，胃溃疡的治愈率可显著提高。黄芪具有补气固表、托毒排脓的功效；三七则具有散瘀止血、消肿定痛的功效。两种药味在养胃颗粒治疗胃溃疡中起主要作用，靶标亲和活性实验结果和LC-MS含量测定结果充分验证了该制剂组方与辨证的合理性。

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷回收率测定结果

表3 三七皂苷R1回收率测定结果

表4 十批养胃颗粒测定结果(mg/g)

含量测定方法选择方面，LC-MS采用特征离子对分析的检测方法，很大程度上免除了传统液相色谱对各成分进行分离和指认的繁琐过程，分析效率提高，更为适宜基于功效主治的中药多指标含量测定和质量标准研究。本研究结果表明，制备的不同批次样品中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和三七皂苷R1含量差异较大，这可能是由于制备养胃颗粒所用药材批次不同，目标成分含量差异较大引起。上述结果表明，在选择制备所用药材时，应以目标成分为指标对药材进行质量评价，再根据本研究所得量效关系结果，判断是否采用该批次药材进行投料生产。