油用牡丹籽蛋白质的制备及理化性质研究

2020-06-08陈晓菲蔡建红刘晓燕任伟伟

实用药物与临床 2020年3期

陈晓菲，蔡建红，刘晓燕，任伟伟

0 引言

油用牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)属毛茛科芍药属牡丹组木本植物。牡丹籽含油量20%以上；油脂中不饱和脂肪酸含量为80%～92%，其中α-亚麻酸含量为32%～67%，亚油酸含量为19%～35%[1-2]，牡丹籽油已被原国家卫生部批准为新资源食品。随着近几年我国油用牡丹种植面积的急剧扩大，油用牡丹产业蓬勃发展，随之产生了大量的牡丹籽粕。牡丹籽粕蛋白质含量达25%，营养丰富[3]。因此，对牡丹籽粕蛋白进行研究，促进其精深加工与应用，具有极高的经济价值和极大的营养保健价值[4]。

本文利用碱提酸沉提取牡丹籽蛋白质，并对提取工艺进行正交优化，同时就牡丹籽蛋白的理化性质进行研究，以期为牡丹籽的研究与开发提供理论基础。

1 仪器与试药

牡丹籽购买于山东菏泽尧舜牡丹生物技术有限公司，经南京中医药大学生药学教研室鉴定为毛茛科芍药属牡丹的种子；考马斯亮蓝G250(北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化钠等其他试剂为分析纯。WF-万能粉碎机(江阴市康和机械制造有限公司)；紫外分光光度计UV7[梅特勒-托利多，国际贸易(上海)有限公司]；pHS-3C酸度计(上海雷磁仪器有限公司)；JY-SCZ2型双垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)。

2 方法

2.1 提取工艺流程牡丹籽适当粉碎，95%乙醇脱脂，减压过滤后晾干备用。精密称取脱脂牡丹籽适量，加蒸馏水混匀，调节pH值至碱性，水浴加热提取，离心，取上清，调节pH值至酸性，离心，弃上清，用蒸馏水洗涤沉淀至中性，冷冻干燥，即牡丹籽粗蛋白[4]。

2.2 蛋白质含量测定分别精密移取牛血清蛋白标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml于试管中，补蒸馏水至1.0 ml，混匀，加5.0 ml考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，静置5 min，595 nm处测定吸光度。以蛋白标准溶液浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质含量(mg)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。通过线性回归得出方程为：Y=7.793 1 X+0.015 2，线性范围为0～0.09 mg/ml，相关系数r=0.999 6。

2.3 单因素考察与正交优化称取2.0 g牡丹籽干粉若干份，分别选取液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(ml/g)]、提取时间(35、40、45、50、55 min)、pH值(9.0、9.5、10、10.5、11)、提取温度(30、35、40、45、50 ℃)进行单因素试验。在单因素试验基础上，采用正交试验优化牡丹籽蛋白的提取工艺。

2.4 牡丹籽蛋白质理化性质研究

2.4.1 牡丹籽蛋白质红外色谱取冷冻干燥牡丹籽蛋白质样品适量，与干燥KBr粉末充分研磨后压片，于4 000～400 cm-1波段扫描。

2.4.2 牡丹籽蛋白质的分子量目前测定蛋白质相对分子量常用的技术之一为SDS-PAGE电泳，按照Laemmli法[5]进行凝胶电泳，确定牡丹籽蛋白质相对分子量。电泳条件为：5%浓缩胶，12%分离胶，采用200 mA电流，进行2.5 h。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果

3.1.1 液料比对蛋白质提取量的影响液料比对于牡丹籽蛋白质的提取量具有十分关键的影响。液料比过大，可能造成蛋白质的提取率降低；且其余杂质也容易一起提取出来，从而影响蛋白质纯度，加大后续纯化的难度。若液料比过小，容易出现蛋白质提取不充分的情况[6]。因此,本实验在pH值为9、提取温度50 ℃、提取时间50 min的条件下，考察液料比对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图1所示，在料液比为10∶1～30∶1(ml/g)时，牡丹籽蛋白质提取量随提取溶剂体积的增加而增大，当液料比为30∶1(ml/g)时，牡丹籽蛋白质提取量达到最大；随着溶剂体积继续增加，牡丹籽蛋白质提取量基本保持不变。

3.1.2 提取时间对蛋白质提取量的影响提取时间是影响蛋白质提取量的重要因素之一。若提取时间过短，容易出现蛋白质提取不充分的情况，造成资源的浪费。若提取时间过长，可能会导致蛋白质的结构发生改变，影响蛋白质的提取率和稳定性。因此，在pH值为9、提取温度50 ℃、液料比30∶1(ml/g)的条件下，考察提取时间对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图2所示，在35～45 min内，蛋白质提取量随提取时间增加而增大，在提取时间为45 min时，提取量达到最大。当提取时间超过45 min后，牡丹籽蛋白质提取量逐渐降低。

图1 液料比对蛋白质提取量的影响

图2 提取时间对蛋白质提取量的影响

3.1.3 pH值对蛋白质提取量的影响由图3可知，在一定pH值范围内，牡丹籽蛋白质提取量随pH值升高不断增大，当pH值超过10.0时，蛋白质含量下降，可能因为随溶液pH值的升高，改变了蛋白质表面带电情况。在碱性溶液中，蛋白质所带负电荷增加，影响了蛋白质与溶剂之间或者蛋白质分子与分子之间的相互作用，影响其溶解性[7]。

3.1.4 提取温度对蛋白质提取量的影响提取温度是影响蛋白质提取量的重要因素之一。若提取温度过低，则蛋白质提取效率较低。若提取温度过高，致蛋白质的结构发生变性，影响蛋白质的生物活性和稳定性[8]。因此，在pH值为9、液料比30∶1(ml/g)、提取时间50 min的条件下，考察提取温度对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图4所示，在提取温度为30～40 ℃，牡丹籽蛋白质提取量随温度增加不断增大，温度超过40 ℃，蛋白质含量降低。

图3 pH值对蛋白质提取量的影响

图4 提取温度对蛋白质提取量的影响

3.2 正交试验结果由表1～表3可知，以牡丹籽蛋白质提取量为指标，影响提取牡丹籽蛋白质提取量的4个因素中，液料比影响最大，其次是提取时间、提取温度，pH值影响最小，即C>B>D>A。牡丹籽蛋白质提取较优方案为A3B1C2D2，即pH值为10.5，提取40 min，液料比25∶1(ml/g)，提取温度40 ℃。

表1 牡丹籽蛋白质提取工艺因素水平表

3.3 牡丹籽蛋白质理化性质研究

3.3.1 牡丹籽蛋白质红外色谱分析由图5可知，在3 395.79 cm-1强而宽的吸收峰为N-H键的伸缩振动，在2 933.19 cm-1处吸收峰为费米共振，在1 655.68 cm-1处强吸收峰为C=O键的伸缩振动，1 536.10 cm-1处为N-H弯曲振动和C-N伸缩振动吸收峰，1 322.25、1 281.50、1 238.61 cm-1处为C-N和N-H弯曲振动吸收峰，594.82 cm-1处吸收峰为C=O面外弯曲振动吸收峰。