海南某三甲医院多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM表达及与耐药表型的关系研究

王生成，杨祚明，蔡潇阳，张素领，王晓峰

0 引言

铜绿假单胞菌(Paeudomonasaeruginosa，Pa)属于非发酵菌假单胞菌属，是医院内常见的条件致病菌之一，在呼吸科和ICU感染率高，常感染免疫力低下患者[1-5]。Pa对多种抗生素产生耐药作用，给临床治疗带来极大的挑战，其临床分离率仅次于大肠埃希菌[6]。Pa的耐药机制复杂，外排泵系统在耐药机制中发挥重要作用，目前发现的有7种外排泵系统。虽然目前研究者对外排泵系统的功能尚不完全清楚，但是已经认识到外排泵对Pa耐药性的重要作用。有报道，外排泵可能通过将药物泵出菌体外发挥耐药作用[7]。研究发现，海南西部地区Pa的感染率较高，且其中4个外排系统MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM受到多种危险因素的调控[8-9]。由于检测难度较大，我们参考上述文献报道[8-9]对MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM 4个主动外排系统的表达情况及调控机制进行研究，以期为临床治疗提供思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 选取2016年9月至2018年10月儋州市人民医院微生物培养室分离的Pa 54株，菌株均经法国生物-梅里埃公司所产的VITEK全自动微生物分析系统(BioMerieux)鉴定，其中多重耐药(对2种或者2种以上抗生素耐药)菌株36株，全部敏感菌株18株。参考菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922，对照株Pa01，MexAB-OprM过度表达株CR1，MexXY过度表达株N135。

1.2 试剂和仪器 MH琼脂购自青岛海博生物技术有限公司，外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(Phe-Arg-β-naph，PA βN)购自Sigma公司，抗菌药物美罗培南购自日本盐义制药株式会社，其余13种抗菌药物均购自中国药品生物制品检定所；TRIzol试剂盒、RNA反转录试剂盒购自中国大连TAKARA公司，SYBR GreenPCR Master Mix试剂盒购自美国Bio-Rad公司，DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，Tap DNA聚合酶购自BioStar公司。DU-650紫外分光光度计购自美国Beckman公司，HZQ-F160全温振荡培养箱购自澳大利亚Corbett公司，低速高温离心机、荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，ABI PRISM 3700测序仪。

1.3 抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)测定 按照CLSI 2014年规定的临界标准判定每株Pa对抗菌药物的敏感性，琼脂稀释法测定14种抗菌药物对Pa的MIC。干预实验测定耐药菌株加外排泵抑制剂PA βN(终浓度为50 mg/L)对头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、亚胺培南的MIC。

1.4 Pa总RNA的提取 Pa单菌落接种于LB培养板中，过夜培养，严格按照TRIzol试剂盒说明书提取Pa总RNA。紫外分光光度计测定，记录D260/280(RNA浓度)、D260/230(RNA纯度)，根据测定值计算mRNA浓度。按照反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，反应条件设置为30 ℃ 10 min，42 ℃ 30～50 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.5 RCR预实验测定 反转录产物加无酶ddH2O稀释10倍作为预实验模板进行PCR反应，Primer Premier 5.0进行目的基因和内参基因的16SrRNA引物设计，引物序列如表1所示，由上海生工公司合成。PCR反应使用HS Ex Tap酶，反应条件设置为94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共进行30个循环，20 ℃ 5 min。反应结束后反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带单一产物表明反应产物专一，无二聚体，可继续用于RT-PCR。

1.6 RT-PCR检测膜融合蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表达水平 荧光定量PCR仪进行qRT-PCR检测mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表达水平，引物序列根据文献设计如表1所示[10]，反应体系为25 ml：Ultra SYBR Mixture 12.5 ml，cDNA 2.0 ml，上下游引物各0.5 ml，无RNA酶H2O 9.5 ml。SYBRGreen法荧光定量PCR参数设置为95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。采用2-△△Ct法对所得数据进行分析，获得半定量基因的表达量。

1.7 PCR扩增调控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ及DNA测序 用煮沸法提取54株细菌的基因组DNA，分别扩增其调控基因mexR、nfxb、mexT、mexZ[11]。PCR反应体系为50 ml，PVR-magicMix 2.0 25 ml，DNA模板5，反应条件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s,进行30个循环，72 ℃ 10 min。对扩增产物进行纯化，以纯化后产物送上海生工科技有限公司进行测序，测序结果使用Blast与GenBank已知序列进行比对，引物序列如表1所示。

表1 引物信息

2 结果

2.1 抗菌药物最低抑菌浓度的测定 54株Pa中有36株为多重耐药，18株为全部敏感株，对抗菌药物的耐药性、中介及敏感性如表2所示。其中耐药性按照高低顺序排列依次为：头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素、哌拉西林、环丙沙星、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、美罗培南、亚胺培南/西司他丁、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、阿米卡星。

表2 抗菌药物耐药性高低的比较

2.2 干预实验结果 琼脂稀释法测定在PA βN干预下36株多重耐药菌株的MIC，中位数法表示各组MIC值，23株对头孢噻肟的敏感性由64～512 g/ml提高到4～256 g/ml，31株对庆大霉素的敏感性由1～64 g/ml提高到0.25～32 g/ml，26株对环丙沙星的敏感性由4～256 g/ml提高到1～64 g/ml，对亚胺培南的MIC降低为原来的1/4。见表3。

表3 抗菌药物耐药性高低的比较

2.3 膜融合蛋白基因的mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表达水平 外排泵系统在野生菌中低表达，本研究选择野生菌株Pa01为参考，目的基因mexA、mexC、mexE、mexX的相对表达量高于参照株Pa01的相对表达量(9 544、1 028、110.556、72.12)即为高表达菌株。对多重耐药菌株进行筛选，筛选出18株mexA高表达菌株，占总菌株数的33.33%(18/54)，筛选出9株mexC高表达菌株，占总菌株数的16.7%(9/54)，筛选出12株mexE高表达菌株，占总菌株数的22.22%(12/54)，筛选出14株mexX高表达菌株，占总菌株数的25.92%(14/54)；即18株Pa高表达MexAB-OprM外排系统，9株Pa高表达MexCD-OprJ外排系统，12株Pa高表达MexEF-OprN外排系统，14株Pa高表达MexXY-OprM外排系统。6株主动外排泵系统检测阴性株，均无mexA、mexC、mexE、mexX的高表达。30株主动外排泵检测阳性株及6株主动外排泵系统检测阴性株的筛选试验及基因表达水平结果如表4所示。

2.4 外排泵系统在多重耐药Pa中的作用 琼脂稀释法测定加入抑制剂的Pa菌株对头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、亚胺培南的敏感性，18株MexAB-OprM外排泵高表达Pa株与低表达Pa株比较，对头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星的MIC为2～64 μg/ml，9株MexCD-OprJ高表达株中6株对头孢噻肟的敏感性MIC为2～128 mg/ml，12株MexEF-OprN中对环丙沙星、亚胺培南的敏感性MIC为4～128 mg/ml，14株MexXY-OprM为庆大霉素、环丙沙星高度耐药菌株。

表4 36株Pa 4种泵出系统的表达情况及外排泵筛选试验结果

2.5 mexR、nfxB、mexT、mexZ序列分析 分别随机选择mexA、mexC、mexE、mexX高表达菌株中的4个菌株，提取基因组DNA扩增其调控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ，对扩增产物进行纯化测序，并与GenBank中多对应序列进行对比。mexR高表达菌株中3个发生mexR基因突变，分别为第661位、第670位、第688位，第665位mexR编码提前终止；4个nfxB高表达菌株中均发生82位的突变；4个mexT高表达菌株中均发生26位的突变；4个mexZ高表达菌株中2个发生138位的突变，一个发生50位的突变。突变结果如表5所示。

注：Ser：丝氨酸，serine；Gly：甘氨酸，glycine；Val：缬氨酸，valine；Gln：谷氨酰胺，glutamine；Asn：天冬酰胺，asparagine；Arg：精氨酸，agrinine；Leu：亮氨酸，leucine；His：组氨酸，histidine

3 讨论

Pa中4个主动外排系统为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM[11-12]，外排系统的作用主要依赖细胞膜上的主动外排蛋白，主要包括连接膜与相关外排蛋白的膜连接蛋白MexA、MexC、MexE、MexX，转运抗生素作用的蛋白MexB、MexD、MexF、MexY，控制抗生素出入的外膜通道蛋白OprM、OprJ、OprN、Opr4。Pa的耐药机制较为复杂，研究显示，外排泵系统在耐药机制中发挥重要作用，MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM外排泵系统均为RND家族，均由外膜蛋白、内膜转运体、膜融合蛋白3部分组成。目前所涉及的耐药机制主要有以下几个方面：①外膜蛋白OprM等形成门通道，引起菌体包膜的通透性改变，使药物排出菌体外；②内膜转运体MexB、MexD等可识别药物并将药物主动排出细胞膜；③膜融合蛋白MexA、MexC等位于内外膜中间，连接内外膜。3种蛋白连接在一起形成一个连续通道，使进入菌体内的抗菌药物从菌体内排除，药物因达不到有效浓度而失效，且菌体对该种药物产生耐药性[13-15]。外排泵系统中的任何一部分失活都会引起菌株敏感性的提高[16]。

外排泵抑制剂具有抑制外排泵活性、减少细菌外排、提高抗菌药物敏感性的作用。PA βN是一个低分子多肽，具有抑制外排泵表达的作用，还能够降低Pa的侵袭性[17]。Coban等[18]研究表明，PA βN在16 mg/ml时，可以显著降低对喹诺酮类耐药的Pa对环丙沙星的MIC。本研究采用琼脂稀释法测定应用外排泵抑制剂Pa对抗菌药物的MIC的改变。结果显示，Pa对头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星3种药物的MIC均降低，表明添加抑制剂后可以降低外排泵的活性，提高菌体内药物的有效浓度。

近年来研究发现，外排泵mRNA的表达水平可以反映蛋白表达水平[19]。故本实验采用RT-PCR检测4种外排系统中膜连接蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的表达，结果显示，36株多重耐药菌株的mRNA表达水平均有所提高，且多个菌种表达不止一种外排泵系统，表明这些耐药菌株的多重耐药性可能是外排泵过度表达引起的。加入外排泵抑制剂后，可以发现耐药菌株对头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、亚胺培南的MIC均有所下降，进一步证实抑制外排泵系统的活性可以降低Pa的MIC。

研究发现，外排泵系统过度表达受到上游调控基因的影响，基因的突变导致外排泵系统过度表达[20]。有报道，外排系统mexR编码的MexR蛋白与MexAB-OprM的增强子结合，起到转录抑制的作用[21]。Nabl突变株中，mexR突变导致MexAB-OprM失去抑制表达增加，耐药性增强[22]。本研究结果显示，4个mexA高表达菌株中3个发生mexR基因突变；mexC高表达菌株中均发生nfxB的突变，mexE高表达菌株中均发生mexT的突变，mexX高表达菌株中3个发生mexZ的突变，表明外排泵系统的过度表达是受到调控基因突变的影响，引起氨基酸的变化，进而引起蛋白的变化。

综上所述，多重耐药Pa的MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的过度表达是引起Pa多重耐药的主导，且外排系统受到相应调控基因的影响。本研究尚存在不足之处，对每个外排系统的具体分子作用机制尚未研究清楚。