黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠血清IL-1β、TNF-α、NGF和坐骨神经NGF mRNA的影响

周 雯，方 颖，储全根，王亚东，黄万秋，张澳门，梁 雯，孙玉敏

(1.安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；3.安徽中医药大学发展规划处，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012)

糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症，根据中国2型糖尿病防治指南，其主要分为周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)和自主神经病变[1]。DPN好发于下肢，多不可逆转，主要表现为疼痛、麻木、针刺感、蚁行感、电击感、烧灼感、冷感、各种深浅感觉减退或缺失等感觉症状。其中又以累及双侧末梢神经的感觉症状和自主神经症状为主[2]。DPN可引起多系统功能障碍，故也是糖尿病患者致残、致死的主要原因[3]，且目前西医对其缺乏理想的治疗方法[4]。DPN发病机制复杂，近年来的研究逐步证实神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在该病发病中的作用[5]。中医学认为DPN属于“痹证”“血痹”“痿证”等范畴，为消渴之变证。黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略》，有益气通阳、和营行痹之效，该方为治“血痹”而设，亦为治疗DPN的常用经方，临床研究也发现此方治疗DPN安全有效[6-8]。有研究表明，黄芪桂枝五物汤可提高患者血清NGF水平[9]，提示黄芪桂枝五物汤可能是通过影响NGF mRNA的表达来发挥治疗DPN的作用。本实验通过建立DPN大鼠模型，观察黄芪桂枝五物汤对大鼠坐骨神经中NGF mRNA及血清白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NGF表达水平的影响，并探讨其治疗DPN的可能机制。

1 材料

1.1 动物 72只SPF级雄性健康Wistar大鼠，体质量(160±20)g，由安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(皖)2018-002]提供。大鼠自由摄食饮水，适应性饲养1周后，按照随机数字表法将其分为空白对照组，模型组，黄芪桂枝五物汤高、中、低剂量组和甲钴胺组，每组12只。

1.2 药品 黄芪桂枝五物汤由黄芪、芍药、桂枝各9 g，生姜18 g，大枣4枚组成，饮片由安徽中医药大学第一附属医院提供，水煎后浓缩，含生药量1 g/mL，4 ℃冰箱保存。甲钴胺(批号18160118)购自北京星昊医药股份有限公司。

1.3 试剂 大鼠试剂盒(JYM0419Ra)、TNF-α试剂盒(JYM0419Ra)：武汉基因美科技有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(批号S17049)：美国Sigma公司； SYBR qPCR SuperMix Plus(批号 0512841)：江苏近岸蛋白质科技有限公司； first Strand cDNA Synthesis试剂盒(批号00691399)：美国赛默飞世尔科技； DEPC水(批号 1803G26)：北京靖瑞百康生物技术有限公司；引物合成：生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.4 仪器 GL-88B漩涡混合器：海门其林贝尔仪器制造有限公司；RT-6000酶标仪：深圳雷杜生命科学股份有限公司；荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96)、上样辅助仪(10212432C)：美国赛默飞世尔科技；微孔板迷你离心机(MINI-P25)：杭州奥盛仪器有限公司；普通PCR仪(K960)：杭州晶格科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 DPN动物模型复制 采用高脂饮食加腹腔注射STZ方法诱导DPN模型[10]。6组大鼠饲养环境(温度 20～22 ℃，湿度 40%～60%)相同，空白对照组以普通饲料喂养，保持自由摄食饮水，其余各组连续4周喂饲高脂饲料(普通饲料70%、猪油10%、蔗糖20%)和水，4周后，禁食12 h，自由饮水，于大鼠左下腹腹腔按35 mg/kg单次注射2% STZ溶液，用药后72 h，于尾尖处取血测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L及观察机械痛阈值(paw mechanical withdrawal threshold，PMWT)降低和足底热敏反应时间延长者作为DPN模型复制成功标志。模型复制成功后，黄芪桂枝五物汤高、中、低剂量组每日分别采用黄芪桂枝五物汤19.40、4.85、2.43 g/kg灌胃，连续给药12周；甲钴胺组每日用甲钴胺0.25 mg/kg灌胃；空白对照组和模型组每日给予等容积生理盐水灌胃。

2.2 标本取材 模型复制结束时，用0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清。用弯剪剪去大鼠左后肢的被毛，露出皮肤，沿着股骨干后缘剪开皮肤、肌肉，小心剥离筋膜肌肉，暴露坐骨神经，用玻璃分针游离坐骨神经，剪下，放置液氮冻存。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠血清NGF、IL-1β、TNF-α水平测定 采用ELISA法测定血清中NGF、IL-1β、TNF-α水平，严格按照酶联免疫分析试剂盒说明书进行操作。

2.3.2 荧光定量PCR检测NGF mRNA水平 以β-actin为内参照，荧光定量PCR检测NGF mRNA表达水平。

2.3.2.1 提取总RNA ①称取坐骨神经组织50～100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL Trizol匀浆。②加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置5 min。③4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，取上清(约500 μL)，加入另一个EP管中。④加入0.5 mL预冷的异丙醇，温和混匀，冰上孵育30 min。⑤4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，弃去上清。⑥加入1 mL预冷的75%乙醇。4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清。⑦重复步骤⑥。⑧室温干燥RNA沉淀，加入20～50 μL DEPC水，-80 ℃保存备用。

2.3.2.2 合成引物 β-actin引物序列：上游5′-GAGCGCAAGTACTCTGTGTG-3′，下游5′-CCTGCTTGCTGATCCACATC-3′，82 bp。NGF引物序列：上游5′- CTATCCTGGCCACTCTGAGG-3′，下游5′- TTAGTCCAGTGGGCTTCAGG-3′，147 bp。由安徽欣乐生物技术有限公司设计并合成引物。依据以下步骤测定各基因mRNA的表达水平。

2.3.2.3 RT反应 ①在0.2 mL EP管中，加入总RNA(质量为1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL DEPC水补足至11 μL，轻轻混匀，点动离心。②PCR仪上65 ℃加热5 min，立即冰浴3 min。③在上述EP管中加入5倍反应缓冲液4.0 μL、10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合物2 μL、核糖核酸酶抑制剂1 μL、逆转录酶 1 μL。④42 ℃延伸60 min； 70 ℃灭活逆转录酶5 min。⑤取出上述反应液，即为cDNA，-80 ℃保存备用。

2.3.2.4 荧光定量PCR反应 取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系为cDNA 1 μL、2倍SYBR Green 混合物 5 μL、引物(10 μmol/L)1 μL、无RNA酶的水 2 μL。反应条件：预变性95 ℃，1 min；变性95 ℃，20 s；退火与延伸60 ℃，1 min，扩增40个循环后，用RQ值(2-ΔΔCt)表示待测基因mRNA的相对表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠血清NGF、IL-1β、TNF-α水平比较 由于实验人员采血操作不当，导致部分大鼠没有取得血液样本，故获取每组数据10份。与空白对照组比较，模型组大鼠血清NGF水平降低，IL-1β、TNF-α水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各治疗组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平显著降低，NGF水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。黄芪桂枝五物汤升高血清NGF，降低血清IL-1β、TNF-α的作用呈现明显的剂量依赖性，以高剂量的作用最显著。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、NGF水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与甲钴胺组比较，△P<0.05；与黄芪桂枝五物汤高剂量组比较，◇P<0.05

3.2 各组大鼠坐骨神经组织NGF mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠坐骨神经NGF mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠坐骨神经NGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；黄芪桂枝五物汤升高大鼠坐骨神经NGF mRNA表达水平的作用呈现剂量依赖性，以高剂量的作用最显著。见表2。

表2 各组大鼠坐骨神经组织NGF mRNA表达水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与甲钴胺组比较，△P<0.05；与黄芪桂枝五物汤高剂量组比较，◇P<0.05

4 讨论

DPN的发病机制尚不完全清楚，在其发病机制研究中，氧化应激、调控炎症反应和神经营养素缺乏等[11]越来越引起人们的关注。大量研究表明，周围神经损伤后，体内可以启动一系列神经修复再生机制，产生多种细胞因子和神经营养因子，促进神经的修复。DPN的发病机制可能与各种致病因素抑制周围神经受损后的再生修复能力有关[3]。NGF是神经营养因子中最重要的生物活性分子之一，具有营养神经细胞，促进突起生长和促进血管细胞增生的双重生物学功效，在神经系统的发育、成熟及损伤修复期均发挥重要作用[12]。NGF在DPN中的重要作用提示，提高NGF的表达及其生物学效应是防止和延缓DPN的重要途径。

对DPN的治疗，中医古典文献并无相关阐述。随着现代医学科技的发展，有学者提出DPN的发病症状与《金匮要略》中“血痹”相似，也有学者对DPN的中医证候进行了研究，发现黄芪桂枝五物汤可以有效对症治疗DPN。中医学认为该病为气虚血瘀、阴虚血瘀、痰瘀阻络、肝肾亏虚所致，治疗当益气通阳、和营行痹通络。仝小林[13]认为气滞血瘀、气血虚弱为DPN的基本病机，治疗当益气养血、行气活血通络，其从“络病”辨治DPN，认为该病以凉、麻、痛、胀为主症，以气虚血瘀为基本病机，选用黄芪桂枝五物汤为基本方加减，获得良好疗效。朱学敏等[14]用本方治疗DPN 70例，总有效率为92.1%，证明本方对改善DPN引起的肢体凉、麻、痛等症状效果较好。经大量动物实验亦发现，黄芪桂枝五物汤可改变大鼠坐骨神经组织中神经营养因子的表达含量[15]，减少DPN模型大鼠坐骨神经中氧化应激带来的周围神经损伤[16],降低血糖[17],从而达到治疗DPN的作用。研究显示，黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠周围神经功能的改善作用与其剂量成正比[18]。

本研究运用RT-PCR技术，从基因及蛋白水平观察黄芪桂枝五物汤对DPN大鼠坐骨神经NGF mRNA的表达和血清NGF水平的影响。结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平上升，坐骨神经NGF mRNA水平明显下调，血清NGF水平下降(P<0.05)，提示糖尿病时体内IL-1β、TNF-α上升造成的炎症反应及NGF减少造成的神经组织保护和修复功能减弱，是引起DPN发生后神经纤维不能修复的主要原因。各组药物治疗后大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，坐骨神经NGF mRNA水平，血清NGF水平均有不同程度的回调，血清IL-1β、TNF-α水平明显降低，相关炎症介质的释放减少，神经组织炎症损伤减轻。NGF mRNA基因表达水平增加，促进神经细胞修复，且各治疗组与模型组相比差异显著。本实验中，黄芪桂枝五物汤与西药甲钴胺比较，其中高剂量组与甲钴胺组效果相当。甲钴胺是目前临床上治疗DPN的常用西药，但其不良反应的发生率可达8.2%[19]，严重者甚至可出现致命性的呼吸心跳骤停[20]。与甲钴胺相比，黄芪桂枝五物汤临床安全性较高。该方出自《金匮要略》，由黄芪、芍药、桂枝、生姜、大枣五味药物组成。方中君药黄芪补气行血。桂枝通阳益气，既可祛除外邪，又可温通经络，与黄芪相伍，共奏益气和血、温经通络之效。芍药养血和营、缓急止痛，与桂枝合为臣药，调和营卫，共助君药益气行血之力。生姜助黄芪、桂枝通痹之功，为佐药。大枣补中益气、调和诸药，可助桂枝、芍药调和营卫之功，为使药。现代药理研究表明，黄芪有效成分如黄芪皂苷、黄芪多糖、黄酮类化合物具有双向调节血糖、清除自由基、增强神经生长因子、保护神经细胞的作用[21-22]。桂枝有较强的解痉镇痛功效[24]。芍药中主要的活性成分可通过抗炎、降血糖、解热镇痛、清除自由基等多个环节发挥神经保护作用[25-26]。生姜中含有丰富的黄酮类化合物，有较强的抗氧化、清除自由基、降糖、消炎作用[27-28]。

本实验结果表明，黄芪桂枝五物汤可有效降低血清IL-1β、TNF-α水平，减轻周围神经组织炎症损伤；可有效上调坐骨神经NGF mRNA表达水平，升高血清NGF水平，促进损伤神经的修复与再生。