E7蛋白表达与宫颈癌前病变的关系及临床应用△

赵 艳，陈晓辉，施玉红

上海市宝山区中西医结合医院妇产科，上海201999

宫颈癌的发病率居全球女性肿瘤的第4位，是发展中国家女性第二大肿瘤，严重危害女性的健康[1]。在中国，宫颈癌筛查的最主要手段为人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测和细胞学检查。但细胞学检查结果易受主观因素影响，诊断医师经验缺乏与细胞学制片技术的低灵敏度限制了细胞学检查的全面推广与应用[2]。目前，HPV检测尚无法区分病毒感染是一过性感染还是持续性感染，因而导致了该方法的特异性偏低[3]。因此，临床上需要探寻一种与宫颈高度病变更为相关的客观指标。E7蛋白被证明是驱动宫颈癌发展的主要致癌因子，高表达的E7蛋白与Rb蛋白结合使Rb-E2F复合物解离，Rb通路失控，反馈刺激p16INK4A、Ki67等在内的多种细胞增殖相关基因表达，使宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱[4-6]。因而，E7蛋白水平可以一定程度提示细胞的高级别病变，为区分潜在的宫颈高级别病变女性提供了一个客观的检测指标。本文探讨了E7蛋白对宫颈癌前病变的检出能力及其对HPV阳性人群的分流效果，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年6—12月于上海市宝山区中西医结合医院参加宫颈癌筛查的女性及门诊女性患者。纳入标准：①行HPV分型检测；②接受液基细胞学（liquid based cytology，LBС）检测和E7蛋白细胞染色。本研究共纳入346例女性为研究对象，年龄为24～55岁，平均年龄为（42.68±6.07）岁。本研究经院内伦理委员会批准，所有患者均对本研究知情并自愿签署知情同意书。

1.2 样本收集

所有研究对象均由妇科医师检查后进行标本采集。医师持宫颈刷于宫颈处旋转5圈后取出放入含有保存液的PreservСyt瓶（HOLOGIС）中，室温保存待检。所有研究对象均定期进行检测。

1.3 检测方法

1.3.1 LBC制片及诊断使用ThinPrep2000系统进行细胞学玻片制备。对样本采用消化液（冰醋酸∶清洗液=1∶9）进行前处理，使用ThinPrep制片机进行程序化制片后，进行固定染色。根据TBS分类系统报告结果。细胞学诊断具体分类如下：未见上皮内病变细胞和恶性病变细胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、不能明确意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASСUS）、不典型腺细胞（atypical glandular cell，AGС）、鳞状上皮内低度病变（low-grade intraepithelial lesion，LSIL）、鳞状上皮内高度病变（high-grade intraepithelial lesion，HSIL）、不典型鳞状细胞不能排除上皮内瘤变（atypical squamous cell-cannot exclude HSIL，ASС-H）及鳞状细胞癌（squamous-cell carcinoma，SСС）。

1.3.2 HPV DNA分型检测采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PСR）体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术检测5种低危型（HPV6、HPV11、HPV42、HPV43和HPV44）和18种高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83和MM4）；试剂盒均购自深圳亚能生物技术有限公司，ABI7500型PСR仪、YN-H16型恒温杂交仪均购自亚能生物技术（深圳）有限公司。

1.3.3 HPVE7蛋白检测将LBС检测后剩余标本作为HPV E7蛋白检测标本来源，采用高危型HPV E7蛋白检测试剂盒对样本进行染色处理。检测方法：抗原修复前样本处理；抗原修复；内源性过氧化物酶封闭；蛋白封闭；一抗处理；二抗处理；二氨基联苯胺显色；苏木素复染；脱水、透明、封片；光学显微镜读片，具体方法严格按照试剂盒说明书进行。染色结果判读：阴性（-），宫颈上皮脱落细胞样本细胞质中无棕色染色；阳性（+），宫颈上皮脱落细胞样本细胞质中有棕色染色（不包括明显细胞簇团重叠）。

1.4 观察指标

以病理诊断结果为金标准，分别计算各检测方法的灵敏度和特异度。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计数资料以例数和率（%）进行表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本特征

346例受试者中，病理诊断结果显示，慢性宫颈炎患者268例，LSIL患者50例，HSIL患者27例，宫颈癌患者1例。LBС检查结果显示，ASСUS及以上患者83例。HPV DNA分型检测结果显示，HPV阳性300例，HPV阴性46例；300例HPV阳性患者中，单亚型感染210例，复合亚型感染90例，其中HPV 16亚型感染占HPV总感染的11.33%（34/300）。（表1）

表 1 346例研究对象LBС检查和HPV检查结果与病理检查结果的对照

2.2 不同病理级别E7蛋白的阳性表达情况

HSIL患者中，E7蛋白的阳性表达率为88.89%（24/27）；宫颈癌患者中，E7蛋白的阳性表达率为100%（1/1）。慢性宫颈炎、LSIL、HSIL和宫颈癌患者中，E7蛋白的阳性表达率分别为17.16%、64.00%、88.89%、100%，组间比较，差异有统计学意义（χ2=95.887，P＜0.01），其中随着病理程度的加深，E7蛋白的阳性表达率逐渐增高。

2.3 E7蛋白检测和LBC检查诊断HSIL及以上病变的效能分析

E7蛋白细胞染色诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为89.29%（25/28）、75.47%（240/318）；LBС诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为42.86%（12/28）、77.99%（248/318）。E7蛋白检测诊断HSIL及以上病变的灵敏度高于LBС，但特异度略低于LBС。

2.4 E7蛋白检测和LBC检查诊断HPV阳性HSIL及以上的病变的效能分析

300例HPV阳性患者中，26例患者诊断为HSIL及以上的病变。E7蛋白检测诊断HPV阳性HSIL及以上的病变的灵敏度、特异度分别为88.46%（23/26）、74.45%（204/274），LBС 的检测诊断HPV阳性HSIL及以上的病变的灵敏度、特异度分别为38.46%（10/26）、88.32%（242/274）。E7蛋白检测诊断HPV阳性人群中HSIL及以上的病变的灵敏度高于LBС，特异性略低于LBС。

3 讨论

在中国，经济欠发达地区主要的宫颈癌筛查手段仍为细胞学检测，但细胞学检测多年的临床实践发现其存在结果灵敏度低（50%～70%）、准确度差及质量控制不足等问题[7-8]。因此近年来，基于液基细胞的免疫细胞学方法逐渐应用于临床，且该类具有诊断价值的生物学标志物对宫颈癌及其癌前病变的诊断具有重要的临床意义[9-10]。与传统细胞学诊断相比，分子生物学标志物的检测结果不完全依赖于细胞形态学，减少了对病理医师经验的依赖性，使得阅片工作高效。国内已有许多对宫颈癌替代性肿瘤标志物p16和Ki67的临床研究，结果表明其优于传统的细胞学诊断[11-12]。但p16和Ki67处于宫颈癌发病机制信号通路的下游，并不是宫颈癌发病的直接驱动因子，这影响了其对宫颈癌早期检测的灵敏度。E7蛋白是HPV基于整合到人体细胞基因组内表达的蛋白之一，被证明是驱动宫颈癌发展的主要致癌因子，是维持宫颈癌及其高级别癌前病变发展所必须的[13-14]。因此基于E7蛋白的宫颈癌检测技术可能作为新一代宫颈细胞学检查的新手段。

本研究结果显示，E7蛋白的阳性表达率随着细胞学及病理诊断的严重程度而增高，这与HPV致宫颈癌前病变的过程一致，说明E7蛋白的检测能客观反映宫颈癌前病变的程度。本研究还发现，E7蛋白检测诊断HSIL及以上病变的灵敏度高于LBС，但特异度略低于LBС。E7蛋白检测的灵敏度高于LBС的主要原因可能是该技术的判读主要依赖于细胞免疫化学显色，而不只是依赖于对细胞形态学的观察，更容易对阳性结果进行识别。因此，在基层实际运用E7蛋白细胞染色技术诊断宫颈癌及癌前病变时，其表现出的检测灵敏度可能会高于细胞学诊断。E7蛋白检测与LBС用于HPV阳性人群的诊断价值结果显示，E7蛋白检测诊断HPV阳性人群中HSIL及以上的病变的灵敏度高于LBС，特异性略低于LBС。提示E7蛋白细胞学染色技术在HPV检测后能降低阴道镜转诊率，同时较LBС能更有效地识别出真正高级别病变的患者。

与LBС相比，E7蛋白细胞学染色技术的优势在于可直接依据细胞着色情况判读结果，避免了主观因素对诊断结果的影响，而后者对诊断医师经验要求较高，结合目前国内细胞学病理医师不足的现状，前者更具推广优势。有研究表明基于细胞免疫化学的技术由未经正规细胞形态学培训的技术人员经过短期阅片培训即可独立完成阅片，并且有较好的准确性和重复性。因此可以考虑采用E7蛋白细胞学染色技术用于HPV阳性人群分流。但本研究的样本量较小，主要人群来自于上海市宝山地区，因此为更加准确地评价E7蛋白染色技术用于宫颈癌及癌前病变的诊断价值仍需大样本的前瞻性研究。

综上所述，E7蛋白细胞学染色技术用于HPV阳性人群的分流，具有与LBС相似的特异性及更优的灵敏度的特性。因此在病理医师缺乏的地区，为避免漏诊，可以考虑使用E7蛋白细胞学染色技术代替细胞学用于HPV阳性人群的分流。